【摘要】：中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)俗稱河蟹,是一種重要的淡水養(yǎng)殖種類,在我國的淡水養(yǎng)殖業(yè)中占有很大的比重。目前,在中國江蘇省河蟹養(yǎng)殖是一個快速發(fā)展的行業(yè),每年的產(chǎn)值在40億美元左右。然而,隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大及集約化程度的提高,一些由細菌、病毒和寄生蟲引起的疾病嚴重阻礙了河蟹養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,并造成了巨大的經(jīng)濟損失。中華絨螯蟹顫抖病就是其中最嚴重的病害之一,而中華絨螯蟹螺原體(Spiroplasma eriocheiris)是引發(fā)該病的一種新型病原微生物。前期的研究證實,該病原主要通過河蟹的鰓或者體表進入到宿主的體內(nèi),并首先侵染其靶細胞—血細胞,在血細胞中大量繁殖并伴隨著血液循環(huán)進而侵染河蟹的神經(jīng)、肌肉等組織,最終引起河蟹附肢的顫抖并最終導致宿主死亡。河蟹血細胞作為該病原重要的靶細胞,其必定在宿主對該病原的免疫中發(fā)揮重要的作用,因此,探究螺原體侵染河蟹血細胞的機制以及河蟹的免疫防御機制,對減少該病原對河蟹養(yǎng)殖業(yè)的危害具有重要的意義。本碩士學位論文在目前已有的研究基礎(chǔ)上,首先,通過相對定量和絕對定量同位素標記(isobaric tags for relative and absolute quantization iTRAQ)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatographytandem mass spectrometry LC-MS/MS)技術(shù),篩選中華絨螯蟹螺原體感染10天后河蟹血細胞中差異表達的蛋白,并通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)分析該病原可能存在的侵染機制以及宿主對該病原免疫防御機制。其次,通過分析差異表達蛋白,挑選兩種蛋白(Rab7和14-3-3)通過基因克隆、蛋白表達、抗體制備等,進一步研究這兩種蛋白在病原的侵染和宿主的免疫機制當中發(fā)揮的作用。本論文為進一步探究中華絨螯蟹螺原體侵染河蟹的分子機制以及河蟹的免疫機制提供堅實的基礎(chǔ),并為進一步減少螺原體對河蟹養(yǎng)殖業(yè)的危害提供理論依據(jù),該論文主要從以下三個方面來開展研究：1. iTRAQ篩選螺原體感染前后中華絨螯蟹血細胞的差異蛋白本實驗通過iTRAQ技術(shù)篩選螺原體感染前后河蟹血細胞差異表達的蛋白,初步鑒定這些蛋白,根據(jù)功能分為免疫相關(guān)蛋白、生理相關(guān)蛋白以及細胞骨架相關(guān)蛋白等等。本實驗選擇差異倍數(shù)≥1.2的蛋白進行功能分析,實驗中篩選出來的具有統(tǒng)計學意義的差異蛋白(上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白)一共有76種。其中上調(diào)蛋白有35種,下調(diào)蛋白有41種,在這些差異表達的蛋白中大約有20種是與免疫相關(guān)的蛋白。上調(diào)蛋白包括谷胱甘肽轉(zhuǎn)氨酶(prostaglandin D synthase, GST),鐵蛋白(ferritin)和熱休克60(heat shock protein 60, HSP60)等。下調(diào)蛋白包括兩種凝集素蛋白(mannosebinding protein and hemocytin)、三種絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白(two serpins and pacifastin)、三種不同的絲氨酸蛋白酶等等。選擇其中的8種蛋白(a2M, GST, ferritin, tubulin, crustin, thioredoxin, clip domain serine protease and serpin),通過實時定量PCR (qRT-PCR)的方法檢測其對應(yīng)蛋白在基因水平的變化,實驗結(jié)果表明除了tubulin其余的結(jié)果都與iTRAQ篩選結(jié)果基本保持一致。2.Rab7基因克隆、蛋白原核表達及相關(guān)功能研究Rab7屬于小G蛋白家族中的一種,近期的研究表明Rab蛋白在甲殼類的先天性免疫當中發(fā)揮著重要作用。本研究為了進一步驗證iTRAQ篩選的Rab7蛋白表達變化以及進一步揭示該蛋白在河蟹的免疫反應(yīng)當中發(fā)揮的作用。本實驗首先通過RACE技術(shù)擴增了Rab7的基因全長,并成功在體外完成原核表達、純化以及多克隆抗體的制備。qRT-PCR檢測在螺原體的感染下Rab7 mRNA表達變化,通過Western blot技術(shù)檢測在螺原體的感染下河蟹血細胞當中Rab7蛋白的表達,其結(jié)果與iTRQA基本一致。這一結(jié)果進一步說明了Rab7在河蟹應(yīng)對螺原體的感染中發(fā)揮重要作用。3.14-3-3基因克隆、蛋白原核表達及相關(guān)功能研究14-3-3蛋白是一類酸性可溶性蛋白并且在真核生物中有著廣泛的分布,最近的研究表明14-3-3蛋白在甲殼類的先天性免疫過程當中發(fā)揮重要作用。本研究為了進一步驗證iTRAQ中得到的14-3-3蛋白的表達變化并進一步揭示該蛋白在河蟹的免疫反應(yīng)當中的作用。首先,通過PCR技術(shù)克隆14-3-3的基因,并對序列進行分析。其次,成功在體外完成該蛋白的原核表達,純化以及多克隆抗體的制備純化。qRT-PCR技術(shù)檢測在螺原體的感染下14-3-3mRNA的表達變化,通過Western blot檢測該蛋白在螺原體感染后在河蟹血細胞當中表達變化。這一結(jié)果進一步說明14-3-3在河蟹應(yīng)對螺原體的感染中發(fā)揮重要作用。
【圖文】：

圖２．１橫坐標為鑒定種類，縱坐標為鑒定數(shù)量。Ｔｏｔａｌ邋ｓｐｅｃｔｒａ代表的是二級譜圖總數(shù)，Ｓｐｅ代表的是譜圖數(shù)量，Ｕｎｉｑｕｅ邋Ｓｐｅｃｔｒａ代表的是匹配到特有肋段，Ｐｅｐｔｉｄｅ代表的是鑒定到段，Ｕｎｉｑｕｅ邋Ｐｅｐｔｉｄｅ代表的是鑒定到特有肋段，Ｐｒｏｔｅｉｎ代表的是鑒定到的蛋白質(zhì)。逡逑Ｆｉｇ．２．１邋Ｂａｓｉｃ邋ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｅｏｍｅ邋ｐｒｏｆｉｌｅ邋ｂｙ邋ｉＴＲＡＱ．邋Ｔｏｔａｌ邋ｓｐｅｃｔｒａ邋ａｒｅ邋化ｅ邋ｓｅｃｏｎｄｍａｓｓ邋ｓｐｅｃｔｒｕｍｓ，邋ａｎｄ邋ｓｐｅｃｔｒａ邋ａｒｅ邋化ｅ邋ｓｅｃｏｎｄａｒｙ邋ｍａｓｓ邋ｓｐｅｃｔｍｍｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｑｕａｌｉｔｙ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．邋ＵｎｉｑｕｅＰｅｐｔｉｄｅ邋ｉｓ邋ｔｈｅ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ邋ｐｅｐｔｉｄｅｓ邋ｗｈｉｃｈ邋ｂｅｌｏｎｇ邋ｏｎｌｙ邋ｔｏ邋ａ邋ｇｒｏｕｐ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ，邋ａｎｄ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｓ邋ｔｈｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ．逡逑Ａ邋巧0邋廣邐邐邐邐邐邐邐邐邐逡逑巧．邐Ｉ邋ｔ邋？邐．．．邋ｉ＊邋？邋ｉ．：．邋＂ｔ邋邋邋ＫＫ邋１邐ｉ．ｊ邋■邋＊邋ｗ：．邋＊邋４＞．ｋ邋，＞‘．Ｉ邋？＊？？��？？邋１！邋．邋１ｆｔ邋ｉｉ：邋．邋－邋＞邋ｒ邋＞．＃．邋ｉ邋＼邋？邋）、．＆？：、．逡逑—邋一邐一邐？４－Ｍ邋？？邋Ｃ一一邐■－戶－邋ｇｗ邋－邋－邋一－邋？－一邐？一＊？．一《邋．逡逑Ｑ００邋＇邐．一《邋－邋一邋－邋Ｖ，，邐ｋＪ邐一邋一》４－＊＞＂？，邋？？邋一，１邐．逡逑ｋ＿逡逑皂々巧邐—逡逑５邋４００邐邐邐邐邐邐邐邐邐邐－？？＂？，…逡逑巳邋５５０－

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【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S945

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