【摘要】：中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)俗稱河蟹,是一種重要的淡水養(yǎng)殖種類,在我國的淡水養(yǎng)殖業(yè)中占有很大的比重。目前,在中國江蘇省河蟹養(yǎng)殖是一個(gè)快速發(fā)展的行業(yè),每年的產(chǎn)值在40億美元左右。然而,隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大及集約化程度的提高,一些由細(xì)菌、病毒和寄生蟲引起的疾病嚴(yán)重阻礙了河蟹養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。中華絨螯蟹顫抖病就是其中最嚴(yán)重的病害之一,而中華絨螯蟹螺原體(Spiroplasma eriocheiris)是引發(fā)該病的一種新型病原微生物。前期的研究證實(shí),該病原主要通過河蟹的鰓或者體表進(jìn)入到宿主的體內(nèi),并首先侵染其靶細(xì)胞—血細(xì)胞,在血細(xì)胞中大量繁殖并伴隨著血液循環(huán)進(jìn)而侵染河蟹的神經(jīng)、肌肉等組織,最終引起河蟹附肢的顫抖并最終導(dǎo)致宿主死亡。河蟹血細(xì)胞作為該病原重要的靶細(xì)胞,其必定在宿主對該病原的免疫中發(fā)揮重要的作用,因此,探究螺原體侵染河蟹血細(xì)胞的機(jī)制以及河蟹的免疫防御機(jī)制,對減少該病原對河蟹養(yǎng)殖業(yè)的危害具有重要的意義。本碩士學(xué)位論文在目前已有的研究基礎(chǔ)上,首先,通過相對定量和絕對定量同位素標(biāo)記(isobaric tags for relative and absolute quantization iTRAQ)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatographytandem mass spectrometry LC-MS/MS)技術(shù),篩選中華絨螯蟹螺原體感染10天后河蟹血細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白,并通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析該病原可能存在的侵染機(jī)制以及宿主對該病原免疫防御機(jī)制。其次,通過分析差異表達(dá)蛋白,挑選兩種蛋白(Rab7和14-3-3)通過基因克隆、蛋白表達(dá)、抗體制備等,進(jìn)一步研究這兩種蛋白在病原的侵染和宿主的免疫機(jī)制當(dāng)中發(fā)揮的作用。本論文為進(jìn)一步探究中華絨螯蟹螺原體侵染河蟹的分子機(jī)制以及河蟹的免疫機(jī)制提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),并為進(jìn)一步減少螺原體對河蟹養(yǎng)殖業(yè)的危害提供理論依據(jù),該論文主要從以下三個(gè)方面來開展研究：1. iTRAQ篩選螺原體感染前后中華絨螯蟹血細(xì)胞的差異蛋白本實(shí)驗(yàn)通過iTRAQ技術(shù)篩選螺原體感染前后河蟹血細(xì)胞差異表達(dá)的蛋白,初步鑒定這些蛋白,根據(jù)功能分為免疫相關(guān)蛋白、生理相關(guān)蛋白以及細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白等等。本實(shí)驗(yàn)選擇差異倍數(shù)≥1.2的蛋白進(jìn)行功能分析,實(shí)驗(yàn)中篩選出來的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白(上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白)一共有76種。其中上調(diào)蛋白有35種,下調(diào)蛋白有41種,在這些差異表達(dá)的蛋白中大約有20種是與免疫相關(guān)的蛋白。上調(diào)蛋白包括谷胱甘肽轉(zhuǎn)氨酶(prostaglandin D synthase, GST),鐵蛋白(ferritin)和熱休克60(heat shock protein 60, HSP60)等。下調(diào)蛋白包括兩種凝集素蛋白(mannosebinding protein and hemocytin)、三種絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白(two serpins and pacifastin)、三種不同的絲氨酸蛋白酶等等。選擇其中的8種蛋白(a2M, GST, ferritin, tubulin, crustin, thioredoxin, clip domain serine protease and serpin),通過實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR)的方法檢測其對應(yīng)蛋白在基因水平的變化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明除了tubulin其余的結(jié)果都與iTRAQ篩選結(jié)果基本保持一致。2.Rab7基因克隆、蛋白原核表達(dá)及相關(guān)功能研究Rab7屬于小G蛋白家族中的一種,近期的研究表明Rab蛋白在甲殼類的先天性免疫當(dāng)中發(fā)揮著重要作用。本研究為了進(jìn)一步驗(yàn)證iTRAQ篩選的Rab7蛋白表達(dá)變化以及進(jìn)一步揭示該蛋白在河蟹的免疫反應(yīng)當(dāng)中發(fā)揮的作用。本實(shí)驗(yàn)首先通過RACE技術(shù)擴(kuò)增了Rab7的基因全長,并成功在體外完成原核表達(dá)、純化以及多克隆抗體的制備。qRT-PCR檢測在螺原體的感染下Rab7 mRNA表達(dá)變化,通過Western blot技術(shù)檢測在螺原體的感染下河蟹血細(xì)胞當(dāng)中Rab7蛋白的表達(dá),其結(jié)果與iTRQA基本一致。這一結(jié)果進(jìn)一步說明了Rab7在河蟹應(yīng)對螺原體的感染中發(fā)揮重要作用。3.14-3-3基因克隆、蛋白原核表達(dá)及相關(guān)功能研究14-3-3蛋白是一類酸性可溶性蛋白并且在真核生物中有著廣泛的分布,最近的研究表明14-3-3蛋白在甲殼類的先天性免疫過程當(dāng)中發(fā)揮重要作用。本研究為了進(jìn)一步驗(yàn)證iTRAQ中得到的14-3-3蛋白的表達(dá)變化并進(jìn)一步揭示該蛋白在河蟹的免疫反應(yīng)當(dāng)中的作用。首先,通過PCR技術(shù)克隆14-3-3的基因,并對序列進(jìn)行分析。其次,成功在體外完成該蛋白的原核表達(dá),純化以及多克隆抗體的制備純化。qRT-PCR技術(shù)檢測在螺原體的感染下14-3-3mRNA的表達(dá)變化,通過Western blot檢測該蛋白在螺原體感染后在河蟹血細(xì)胞當(dāng)中表達(dá)變化。這一結(jié)果進(jìn)一步說明14-3-3在河蟹應(yīng)對螺原體的感染中發(fā)揮重要作用。
【圖文】：

圖２．１橫坐標(biāo)為鑒定種類，縱坐標(biāo)為鑒定數(shù)量。Ｔｏｔａｌ邋ｓｐｅｃｔｒａ代表的是二級譜圖總數(shù)，Ｓｐｅ代表的是譜圖數(shù)量，Ｕｎｉｑｕｅ邋Ｓｐｅｃｔｒａ代表的是匹配到特有肋段，Ｐｅｐｔｉｄｅ代表的是鑒定到段，Ｕｎｉｑｕｅ邋Ｐｅｐｔｉｄｅ代表的是鑒定到特有肋段，Ｐｒｏｔｅｉｎ代表的是鑒定到的蛋白質(zhì)。逡逑Ｆｉｇ．２．１邋Ｂａｓｉｃ邋ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｅｏｍｅ邋ｐｒｏｆｉｌｅ邋ｂｙ邋ｉＴＲＡＱ．邋Ｔｏｔａｌ邋ｓｐｅｃｔｒａ邋ａｒｅ邋化ｅ邋ｓｅｃｏｎｄｍａｓｓ邋ｓｐｅｃｔｒｕｍｓ，邋ａｎｄ邋ｓｐｅｃｔｒａ邋ａｒｅ邋化ｅ邋ｓｅｃｏｎｄａｒｙ邋ｍａｓｓ邋ｓｐｅｃｔｍｍｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｑｕａｌｉｔｙ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．邋ＵｎｉｑｕｅＰｅｐｔｉｄｅ邋ｉｓ邋ｔｈｅ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ邋ｐｅｐｔｉｄｅｓ邋ｗｈｉｃｈ邋ｂｅｌｏｎｇ邋ｏｎｌｙ邋ｔｏ邋ａ邋ｇｒｏｕｐ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ，邋ａｎｄ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｓ邋ｔｈｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ．逡逑Ａ邋巧0邋廣邐邐邐邐邐邐邐邐邐逡逑巧．邐Ｉ邋ｔ邋？邐．．．邋ｉ＊邋？邋ｉ．：．邋＂ｔ邋邋邋ＫＫ邋１邐ｉ．ｊ邋■邋＊邋ｗ：．邋＊邋４＞．ｋ邋，＞‘．Ｉ邋？＊？？！？？邋１！邋．邋１ｆｔ邋ｉｉ：邋．邋－邋＞邋ｒ邋＞．＃．邋ｉ邋＼邋？邋）、．＆？：、．逡逑—邋一邐一邐？４－Ｍ邋？？邋Ｃ一一邐■－戶－邋ｇｗ邋－邋－邋一－邋？－一邐？一＊？．一《邋．逡逑Ｑ００邋＇邐．一《邋－邋一邋－邋Ｖ，，邐ｋＪ邐一邋一》４－＊＞＂？，邋？？邋一，１邐．逡逑ｋ＿逡逑皂々巧邐—逡逑５邋４００邐邐邐邐邐邐邐邐邐邐－？？＂？，…逡逑巳邋５５０－

邐邋Ｉ邋蜘邋３—ＩＩ邋灼巧邋Ｉ邋２７１９邐２７１３邐１０７５逡逑Ｔｏｔａｌ邋ｓｐｅｃｔｒａ邋Ｓｐｅｃｔｒａ邋Ｕｎｉｑｕｅ邋ｓｐ？ｃｔｒ＊ａ邋Ｐｅｐｔｉｄｅ邋ＵＷｑｕｅ邋ｐｅｐｔｉｄ＊邋Ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑圖２．１橫坐標(biāo)為鑒定種類，縱坐標(biāo)為鑒定數(shù)量。Ｔｏｔａｌ邋ｓｐｅｃｔｒａ代表的是二級譜圖總數(shù)，Ｓｐｅｃｔｒａ逡逑代表的是譜圖數(shù)量，Ｕｎｉｑｕｅ邋Ｓｐｅｃｔｒａ代表的是匹配到特有肋段，Ｐｅｐｔｉｄｅ代表的是鑒定到的膚逡逑段，Ｕｎｉｑｕｅ邋Ｐｅｐｔｉｄｅ代表的是鑒定到特有肋段，Ｐｒｏｔｅｉｎ代表的是鑒定到的蛋白質(zhì)。逡逑Ｆｉｇ．２．１邋Ｂａｓｉｃ邋ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｅｏｍｅ邋ｐｒｏｆｉｌｅ邋ｂｙ邋ｉＴＲＡＱ．邋Ｔｏｔａｌ邋ｓｐｅｃｔｒａ邋ａｒｅ邋化ｅ邋ｓｅｃｏｎｄａｒｙ逡逑ｍａｓｓ邋ｓｐｅｃｔｒｕｍｓ，邋ａｎｄ邋ｓｐｅｃｔｒａ邋ａｒｅ邋化ｅ邋ｓｅｃｏｎｄａｒｙ邋ｍａｓｓ邋ｓｐｅｃｔｍｍｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｑｕａｌｉｔｙ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．邋Ｕｎｉｑｕｅ逡逑Ｐｅｐｔｉｄｅ邋ｉｓ邋ｔｈｅ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ邋ｐｅｐｔｉｄｅｓ邋ｗｈｉｃｈ邋ｂｅｌｏｎｇ邋ｏｎｌｙ邋ｔｏ邋ａ邋ｇｒｏｕｐ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ，邋ａｎｄ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｓ邋ｔｈｅ逡逑ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ．逡逑Ａ邋巧0邋廣邐邐邐邐邐邐邐邐邐逡逑巧．邐Ｉ邋ｔ邋？邐．．．邋ｉ＊邋？邋ｉ．：．邋＂ｔ邋邋邋ＫＫ邋１邐ｉ．ｊ邋■邋＊邋ｗ：．邋＊邋４＞．ｋ邋
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S945

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 顧宏兵;河蟹健康養(yǎng)殖的“四質(zhì)”問題[J];漁業(yè)現(xiàn)代化;2000年06期

2 陳德貴;河蟹養(yǎng)殖如何提高經(jīng)濟(jì)效益[J];科學(xué)養(yǎng)魚;2000年12期

3 張思忠;規(guī)范河蟹養(yǎng)殖 打響河蟹品牌——崇明河蟹養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)出臺(tái)[J];上海標(biāo)準(zhǔn)化;2000年03期

4 徐成旭;河蟹洄捕率低探因[J];飼料博覽;2000年10期

5 柳富榮;池養(yǎng)河蟹四要點(diǎn)[J];北京水產(chǎn);2000年01期

6 羅遠(yuǎn)忠;河蟹養(yǎng)殖實(shí)用技術(shù)(五)[J];漁業(yè)致富指南;2000年08期

7 鹽興;河蟹養(yǎng)殖做好“四個(gè)調(diào)整”[J];漁業(yè)致富指南;2000年16期

8 徐成旭;河蟹養(yǎng)殖宜四改[J];福建農(nóng)業(yè);2000年03期

9 ;怎樣改善河蟹養(yǎng)殖[J];華夏星火;2000年06期

10 周銀;探討影響河蟹養(yǎng)殖的幾個(gè)問題[J];漁業(yè)現(xiàn)代化;2001年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 馮唐茂;李鐘杰;劉家壽;張?zhí)昧?;湖北洪湖低湖田河蟹池塘養(yǎng)殖模式研究[A];2009年中國水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2009年

2 宋學(xué)宏;;一種生物凈水劑對河蟹養(yǎng)殖水體水質(zhì)凈化效果研究[A];蘇州市自然科學(xué)優(yōu)秀學(xué)術(shù)論文匯編(2008-2009)[C];2010年

3 顧景齡;王慶奎;王茜;;養(yǎng)殖河蟹(Eriochir sinensis)性早熟的原因及防范措施[A];中國動(dòng)物學(xué)會(huì)甲殼動(dòng)物學(xué)分會(huì)、中國海洋與湖沼學(xué)會(huì)甲殼動(dòng)物學(xué)分會(huì)2004年甲殼動(dòng)物學(xué)分會(huì)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2004年

4 陳錦文;劉朝輝;;河蟹池塘高效生態(tài)養(yǎng)殖試驗(yàn)[A];堅(jiān)持科學(xué)發(fā)展觀 推進(jìn)自主創(chuàng)新 促進(jìn)國家創(chuàng)新型城市建設(shè)——武漢市第二屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2006年

5 馬溪平;徐成斌;孫學(xué)凱;李法云;惠秀娟;付保榮;;光合細(xì)菌的分離鑒定及在河蟹養(yǎng)殖中的應(yīng)用[A];第十次全國環(huán)境微生物學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2007年

6 管衛(wèi)兵;;中國河蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展要走生態(tài)養(yǎng)殖路線[A];中國甲殼動(dòng)物學(xué)會(huì)第十一屆年會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2011年

7 趙紅葉;孔一江;;固城湖河蟹養(yǎng)殖區(qū)向水體排放氮磷研究初探[A];2012中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（第二卷）[C];2012年

8 王家軍;葉國平;陳天兄;;應(yīng)縣河蟹產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的問題與對策[A];中國南方十六�。ㄊ�、區(qū)）水產(chǎn)學(xué)會(huì)漁業(yè)學(xué)術(shù)論壇第二十六次學(xué)術(shù)交流大會(huì)論文集（上冊）[C];2010年

9 方曉益;孫露;沈金良;;依托優(yōu)質(zhì)山水資源 再揚(yáng)“鐵殼秤砣”老品牌[A];“杭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與品牌建設(shè)論壇”論文集[C];2008年

10 朱清順;余寧;周剛;張彤晴;;長江水系中華絨鰲蟹良種選育與持續(xù)利用[A];野生動(dòng)物生態(tài)與管理學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2001年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 本報(bào)記者 柳書節(jié);河蟹一枝獨(dú)秀 蓬勃發(fā)展[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報(bào);2005年

2 金陵;河蟹下半年價(jià)格將穩(wěn)中略升[N];中國漁業(yè)報(bào);2006年

3 李劍飛 劉鈞;盤錦工商局大力培育凈化河蟹市場[N];中國漁業(yè)報(bào);2006年

4 千山;鞍山河蟹上市晚 價(jià)格便宜銷售旺[N];中國漁業(yè)報(bào);2007年

5 陳藍(lán)蓀;我國河蟹產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀分析[N];東方城鄉(xiāng)報(bào);2006年

6 本報(bào)記者 陳建濤 通訊員 宮振衛(wèi) 張景智;牛圈村：小河蟹做成大產(chǎn)業(yè)[N];東營日報(bào);2006年

7 金陵;河蟹下半年價(jià)格穩(wěn)中略升[N];江蘇科技報(bào);2006年

8 宣繼琴;今年河蟹價(jià)格穩(wěn)中略升[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報(bào);2006年

9 安徽省天長市多管局 羊茜 占家智;河蟹暫養(yǎng)死亡原因及預(yù)防措施[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報(bào);2007年

10 宋玉珠;嫩江河蟹養(yǎng)殖引領(lǐng)農(nóng)民增收[N];黑龍江經(jīng)濟(jì)報(bào);2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 史兵;河蟹池塘養(yǎng)殖智能支持系統(tǒng)關(guān)鍵技術(shù)研究[D];江蘇大學(xué);2013年

2 劉立鶴;中華絨螯蟹雌體脂質(zhì)營養(yǎng)及生殖調(diào)控研究[D];華東師范大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 胡海彥;江蘇省河蟹產(chǎn)業(yè)化發(fā)展研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

2 王娜;盤山縣農(nóng)民專業(yè)合作社發(fā)展研究[D];延邊大學(xué);2015年

3 胡泉;湖北省河蟹產(chǎn)業(yè)化發(fā)展研究[D];華中師范大學(xué);2015年

4 張晨;稻蟹種養(yǎng)中投喂不同蛋白水平河蟹餌料對稻田生態(tài)系統(tǒng)的影響[D];大連海洋大學(xué);2015年

5 周慧;河蟹養(yǎng)殖環(huán)境監(jiān)測及預(yù)警模型研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

6 金黎明;基于消費(fèi)者行為的江蘇河蟹物流管理研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

7 裴迪;編織藝術(shù)在七里海河蟹綠色包裝設(shè)計(jì)中的應(yīng)用[D];天津科技大學(xué);2013年

8 羅西玲;遼河口蘆葦濕地河蟹養(yǎng)殖區(qū)營養(yǎng)鹽、COD的變化及水質(zhì)狀況評價(jià)[D];中國海洋大學(xué);2015年

9 邢磊;遼河口葦田濕地河蟹養(yǎng)殖區(qū)氮、磷收支特征及環(huán)境評價(jià)的研究[D];中國海洋大學(xué);2015年

10 王志剛;柏各莊農(nóng)場特色農(nóng)產(chǎn)品“恒行”河蟹營銷渠道問題研究[D];天津商業(yè)大學(xué);2016年

本文編號：2679632