【摘要】：斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)具有口味出眾、營養(yǎng)豐富、生長發(fā)育快的特點,在東南亞和我國南方是最具商業(yè)價值的物種之一。近年來因為環(huán)境壓力越來越大,導致感染斑節(jié)對蝦的情況越來越嚴重,致使斑節(jié)對蝦的養(yǎng)殖產業(yè)受到嚴重打擊。其中哈維弧菌(Vibrio harveyi)是一種廣泛存在于海洋環(huán)境中的可以感染甲殼類、魚類、貝類的致病菌,易引發(fā)突眼、慢性皮膚潰瘍、敗血癥等動物病癥。研究發(fā)現(xiàn)致病菌感染可引起斑節(jié)對蝦發(fā)生細胞凋亡。miRNA是調控基因表達的重要因子,在細胞凋亡調控中發(fā)揮重要作用。腫瘤蛋白p53調控的凋亡抑制因子(TRIAP1)可通過抑制細胞凋亡參與體內免疫反應,其基因表達受miRNA調控。本研究通過RACE技術克隆了斑節(jié)對蝦TRIAP1基因cDNA全長;確定了斑節(jié)對蝦TRIAP1基因(PmTRIAP1)在不同組織中的表達模式;對靶向調控PmTRIAP1的miRNA進行了篩選,并利用雙熒光素酶報告實驗驗證其作用靶位點;利用熒光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白免疫印跡法(Western Blot)等方法研究了斑節(jié)對蝦在哈維弧菌應激情況下血細胞中miR-454、miR-145對PmTRIAP1基因表達調控的影響;初步掌握了由哈維弧菌應激所產生的細胞凋亡與miR-454、miR-145及PmTRIAP1之間的關系,具體研究內容如下:(1)斑節(jié)對蝦中的PmTRIAP1的全長cDNA序列共2522 bp,包含11 bp的5'-UTR,2289 bp的3'-UTR,222 bp的ORF,共編碼73個氨基酸,分子量為8.6kDa,理論等電點(PI)為4.9。PmTRIAP1在所有檢測的組織中都有表達,在血細胞中的表達最高,是卵巢中的18.58倍,其次在肝胰腺和腸中表達較高,分別是卵巢的4.37倍和3.49倍,在胸神經(jīng)中表達量最低。序列比對結果顯示,斑節(jié)對蝦中的TRIAP1與柑橘木虱(Diaphorina citri)TRIAP1的相似度最高為61%,在進化上保守性較高。(2)miRNA的篩選:為了找出與PmTRIAP1-3'UTR結合的miRNA,使用Mireap、Miranda、Targetscan軟件共同進行預測得到16種潛在調控PmTRIAP1的miRNA。當斑節(jié)對蝦受到哈維弧菌刺激時,miR-145、miR-454的相對表達量在6 h、24 h、48 h、72 h均有顯著上調。PmTRIAP1的相對表達量在24、48、72h顯著下降,miRNA的表達與PmTRIAP1的表達呈負相關。雙熒光素酶報告結果顯示,miR-454可以調控PmTRIAP1基因3'UTR的熒光素(luciferase)表達(p=0.0047);而在結合位點突變后未檢測到luciferase活性顯著變化。miR-145可以調控帶有PmTRIAP1 3’UTR的luciferase的表達;而在結合位點突變后未檢測到luciferase活性顯著變化。miR-145和miR-454可以調控帶有PmTRIAP1 3'UTR的luciferase的表達(3)miRNA與PmTRIAP1調控關系研究:分別注射miR-145、miR-454的類似物過表達miRNA和注射miR-145、miR-454的抑制物沉默miRNA。過表達miR-145后可在24 h和48 h降低斑節(jié)對蝦血細胞中PmTRIAP1的相對表達量,分別下降0.82和0.54倍;過表達miR-454后可在24 h降低斑節(jié)對蝦血細胞中PmTRIAP1的相對表達量;沉默miR-145可在24 h和48 h增加斑節(jié)對蝦血細胞中PmTRIAP1的相對表達量,沉默miR-454可在24 h和48 h增加斑節(jié)對蝦血細胞中PmTRIAP1的相對表達量。通過TUNEL法檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn):在過表達miR-145和miR-454的第24 h斑節(jié)對蝦血細胞的細胞凋亡相較對照組增多;在沉默miR-145和miR-454后的第24 h斑節(jié)對蝦血細胞的細胞凋亡相較對照組減少。miR-145和miR-454可通過調節(jié)PmTRIAP1的表達調控斑節(jié)對蝦血細胞的細胞凋亡。(4)哈維弧菌刺激下,miR-454、miR-145對PmTRIAP1和細胞凋亡的影響:斑節(jié)對蝦受到哈維弧菌刺激后,使用siRNA干擾PmTRIAP1基因的表達可顯著降低斑節(jié)對蝦血細胞中TRIAP1蛋白的表達量;過表達斑節(jié)對蝦miR-145(注射miR-145-agomir)6 h、24 h、48 h后其血細胞中PmTRIAP1的相對表達量顯著下調;過表達斑節(jié)對蝦miR-454(注射miR-454-agomir)6 h、24 h后其血細胞中PmTRIAP1的相對表達量顯著下調;沉默斑節(jié)對蝦miR-145(注射miR-145-antagomir)6 h、24 h、48 h后其血細胞中PmTRIAP1的相對表達量顯著上調;沉默斑節(jié)對蝦miR-454(注射miR-454-antagomir)6 h、24 h后其血細胞中PmTRIAP1的相對表達量顯著上調。通過TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn),斑節(jié)對蝦受到哈維弧菌刺激后干擾PmTRIAP1基因的表達或過表達miR-145或miR-454,均會增加斑節(jié)對蝦血細胞的細胞凋亡程度;抑制miR-145和miR-454表達會減輕斑節(jié)對蝦血細胞的細胞凋亡程度。以上結果表明,在哈維弧菌刺激下,miR-145和miR-454通過負向調控PmTRIAP1影響斑節(jié)對蝦血細胞的細胞凋亡。
【圖文】：

圖 1-1 TRIAP1 參與細胞凋亡的過程Fig 1-1 Process of TRIAP1 involved in apoptosis1.4 miRNA 簡介MicroRNA（miRNA）是 類長約 18~25 個核苷酸的內源性非編碼小 RNA分子。miRNA 在細胞核內由 RNA 聚合酶 II 或 III（polymerases II or III）轉錄形成具有多聚腺苷酸（polyA）尾巴和帽子結構的 pri-miRNA[32, 33]。pri-miRNA 在DroshaRNase 和它的輔助因子雙鏈 RNA 結合蛋白（DGCR-8）的共同作用下被剪切成 70 nt 具有莖環(huán)結構的 miRNA 前體（pre-miRNA）[34, 35]。在細胞質中 pre-miRNA被RNaseII（IDicer 酶）進 步加工成21-25個核苷酸長度的雙鏈miRNA，隨后與沉默復合體（RNA inducing silencing complex）結合并連接到 Argonaute（AGO）蛋白上，AGO 蛋白展開雙鏈 miRNA 并保留成熟的 miRNA。成熟的miRNA 可以與靶基因以兩種不同機制相互作用（完全匹配或者種子序列匹配）調控目的基因翻譯或降解靶 mRNA 和新合成的多肽鏈[32,36,37]。成熟的 miRNA 與

圖 2-2 PmTRIAP1 系統(tǒng)進化樹使用 Clustal X 進行多重序列比對后用 MEGA7.0 構建 NJ 進化樹。相關 TRIAP1GenBank 注冊號如下：褐鼠：NP_001119571.1，智人：NP_057483.1，黃牛：NP_001073244.1，，家雞：NP_001264437.1，密西西比鱷：XP_006259200.1，熱帶爪蟾：NP_001016268.1，高山蛙：XP_018412920.1 斑馬魚：NP_001153292.2，墨西哥脂肪鯉：XP_007250308.1，柑橘木虱：XP_008467959.1，埃及伊蚊：NP_001073244.1，果蠅：XP_002063899.1，斜紋夜蛾：XP_022814144.1Fig.2-2 Phylogenetic analysis of PmTRIAP1Alignment of amino sequences was produced by Clustal X, and the bootstrap neighbor-joiningphylogeny tree was constructed by MEGA 6.0.GenBank acession numbers encoding TRIAP1 aras follows:Rattus norvegicus: NP_001119571.1, Home sapiens: NP_057483.1, Bos taurus:NP_001073244.1, Gallus gallus: NP_001264437.1, Alligator mississippiensis: XP_006259200.Xenopus tropicalis: NP_001016268.1, Nanorana parkeri: XP_018412920.1, Danio rerio:NP_001153292.2, Astyanax mexicanus: XP_007250308.1, Diaphorina citri: XP_008467959.1Aedes aegypti: NP_001073244.1, Drosophila willistoni: XP_002063899.1, Spodoptera litura:
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S945.4

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本文編號：2679492