【摘要】：副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus, VP)是我國沿海水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要病原菌之一,廣泛存在于海水和海產(chǎn)品中,因致病性副溶血弧菌暴發(fā)性增殖引發(fā)的水生動物疾病每年都會給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在我國,由副溶血弧菌污染引起的微生物食源性疾病居首位,廣西位于我國南部地區(qū),海產(chǎn)品消費量大,人們喜歡食用生的或者半生熟的海產(chǎn)品,因此副溶血弧菌是引起廣西地區(qū)食物中毒最主要的病原菌。耐熱直接溶血毒素(Thermostable direct hemolyticus,TDH)、相對耐熱直接溶血素(TDH-related hemolysin,TRH)和不耐熱溶血素(Themolabile hemolysion,TLH)是副溶血弧菌的主要毒力因子,能產(chǎn)生多種溶血素,分別由tdh、trh和tlh基因編碼。本研究分別從廣西沿海的欽州、北海和防城港3市采集160份凡納濱對蝦病樣,進(jìn)行副溶血弧菌的分離、鑒定以及藥物敏感性試驗,用PCR方法對tdh, trh和tlh毒力基因進(jìn)行檢測,并成功表達(dá)了tlh毒力基因,為蛋白純化、抗體制備及蛋白性質(zhì)研究等領(lǐng)域打下基礎(chǔ),也為副溶血弧菌感染的監(jiān)控和防治提供技術(shù)支撐。獲得的主要結(jié)果有：1.通過常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌分離,運(yùn)用API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和16SrRNA基因序列分析對細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定和分子鑒定。從160份樣本中共檢出副溶血弧菌67株,檢出率為41.88%；利用Blast分析了67株分離菌株的16S rRNA基因序列,與GenBank中已經(jīng)登錄副溶血弧菌相應(yīng)序列的同源性進(jìn)行比對,結(jié)果顯示,67株分離菌株之間高度同源,相似性99.2%～100%,67株分離菌株與副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 17802 (NR 114632.1)的親緣關(guān)系最近,相似性98.8%～100%。藥物敏感性試驗結(jié)果表明,67株副溶血弧菌對復(fù)達(dá)欣、菌必治、復(fù)方新諾明、舒普深、氟哌酸、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、左氟沙星、依諾沙星、氧氟沙星、特治星和氟苯尼考12種藥物的敏感率在80%以上,青霉素G、氨芐青霉素、磺胺二甲嘧啶、鹽酸沙拉沙星和磺胺-6-甲氧嘧啶5種抗生素對67株副溶血弧菌的抑菌能力非常弱,表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐藥性。2.應(yīng)用PCR方法對67株副溶血弧菌進(jìn)行tdh、trh和tlh毒力基因檢測,檢測結(jié)果,67株副溶血弧菌的tdh和trh毒力基因均為陰性,tlh毒力基因均為陽性。3.將擴(kuò)增得到的tlh基因克隆到大腸桿菌原核表達(dá)載體pET-28a上,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a然后轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE電泳證明tlh外源基因發(fā)生了融合表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物與推測的理論產(chǎn)物大小61KDa相符。經(jīng)Western blotting鑒定TLH融合蛋白能與Anti-6×His tag抗體發(fā)生特異反應(yīng),說明TLH溶血毒素在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中準(zhǔn)確表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S945.49

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2677641