【摘要】：骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族(BMP)在脊椎動物骨骼形成發(fā)育,細(xì)胞生長分化以及生殖等多種生理過程中起著重要的作用。BMP對生殖的作用主要是通過卵巢內(nèi)部的BMP-SMADs信號通路來實現(xiàn)的。BMP家族配體在卵母細(xì)胞或濾泡細(xì)胞中合成,通過自分泌/旁分泌的作用方式與卵母細(xì)胞和濾泡細(xì)胞上的Ⅰ型和Ⅱ型跨膜受體(BMPRI和BMPRⅡ)結(jié)合成二聚體,隨后磷酸化下游的SMADs,SMADs進一步調(diào)控目的基因的表達(dá),從而調(diào)控卵巢發(fā)育和成熟。然而,在無脊椎動物中,BMP家族的功能研究,尤其是生殖作用的研究很少,目前尚不清楚BMP家族在無脊椎動物卵巢中是否也存在類似脊椎動物的自分泌/旁分泌機制。本文以我國東南沿海重要的經(jīng)濟蟹類——擬穴青蟹(Scylla paramamosain)為研究對象,通過RACE等分子克隆技術(shù)從擬穴青蟹中克隆得到了配體BMP7、受體BMPRIB和BMPRⅡ的cDNA全長序列,并通過BLAST比對等方法對其核酸和氨基酸序列進行了初步分析;應(yīng)用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)、原位雜交、RNA干擾等技術(shù)探究了 BMP家族基因?qū)β殉舶l(fā)育的影響。此外,針對BMP家族一個重要的配體BMP7,采用卵母細(xì)胞和濾泡細(xì)胞分離、細(xì)胞離體培養(yǎng)和RNA干擾等技術(shù)研究了其對卵巢成熟的作用及其機制。主要的研究成果如下:1)BMP7及其受體在卵巢發(fā)育過程中的功能。從擬穴青蟹中克隆得到BMP7基因全長1279 bp,開放閱讀框為909 bp,編碼302個氨基酸;BMPRIB基因全長2388 bp,開放閱讀框為1557 bp,編碼518個氨基酸;BMPRⅡ基因全長2762 bp,開放閱讀框為1875 bp,編碼624個氨基酸。實時熒光定量PCR表明BMP7、BMPRIB和BMPRⅡ在擬穴青蟹各組織中廣泛分布,尤其是卵巢。配體BMP7在卵黃發(fā)生前期表達(dá)較高,隨著卵巢發(fā)育迅速降低,而受體BMPRs隨著卵巢發(fā)育表達(dá)量不斷升高。原位雜交結(jié)果顯示BMP7 mRNA定位在濾泡細(xì)胞中,而受體BMPRs mRNA則定位在卵母細(xì)胞和濾泡細(xì)胞中。RNA干擾實驗表明,BMPRs的雙鏈RNA(dsRNA)能夠顯著抑制體外培養(yǎng)卵巢組織中SpSmad 1和SpVgR基因的表達(dá)。這些結(jié)果表明,BMP7和BMPRs可能以自分泌/旁分泌的方式參與調(diào)節(jié)了卵巢發(fā)育。2)BMP7對卵母細(xì)胞成熟的影響及其作用機制。采用機械分離的方法,從處于成熟期的卵巢中分離得到濾泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞(裸卵)。半定量PCR的結(jié)果再次驗證了 BMP7、BMPRIB和BMPRⅡ的定位,BMP7主要在濾泡細(xì)胞中表達(dá),而BMPRIB和BMPRⅡ在卵母細(xì)胞和濾泡細(xì)胞中均有表達(dá)。體外培養(yǎng)實驗顯示,在17a,20β-雙羥孕酮的誘導(dǎo)下,青蟹Cyclin B的基因和蛋白表達(dá)量均有升高而SpBMP7基因表達(dá)量下降。當(dāng)去除卵母細(xì)胞與濾泡細(xì)胞之間的間隙連接時,SpBMP7對卵母細(xì)胞成熟的抑制作用并不會受影響。這些結(jié)果表明,BMP7可能以旁分泌的作用方式抑制卵巢成熟,起到避免卵巢過度成熟的作用。綜上所述,擬穴青蟹BMP家族以自分泌/旁分泌的作用方式來調(diào)節(jié)卵巢發(fā)育和成熟,其中BMP7可能對卵巢成熟起到抑制作用。本結(jié)果也為甲殼類卵巢發(fā)育的研究提供了新的思路。
【圖文】：

胞和顆粒細(xì)胞合成分泌，而受體在卵母細(xì)胞和膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞中均有表達(dá)［９，逡逑２９＿３２ＬＴＧＦ－ｐ家族成員的這種特異性表達(dá)通過自分泌／旁分泌作用在卵巢內(nèi)部各細(xì)逡逑胞間形成了一個復(fù)雜的相互調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)，從而調(diào)節(jié)卵巢的發(fā)育和成熟［６］（圖１－１）。逡逑４逡逑

進行相對表達(dá)量分析，運用ＳＰＳＳ邋１７．０軟件分析ｅｖｅｎｅ’ｓ檢驗檢測數(shù)據(jù)的方差同質(zhì)性。采用單因驗來確定Ｐ值。當(dāng)Ｐ＜０．０５為差異顯著。逡逑取逡逑成功提取了比較完整的青蟹卵巢總ＲＮＡ，電泳結(jié)到２８Ｓ、１８Ｓ和５Ｓ的ｒＲＮＡ，，條帶清晰且較鋒利，降解，ｍＲＮＡ彌散分布，可用于后續(xù)ｃＤＮＡ的合
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

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本文編號：2677706