發(fā)布時(shí)間：2020-05-23 15:27

【摘要】：擬穴青蟹(Scylla paramamosain)是我國(guó)東南沿海城市具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的養(yǎng)殖品種。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度的增加,病害問(wèn)題日益嚴(yán)重,成為阻礙產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要瓶頸,而水中溶解氧的缺乏是造成疾病發(fā)生的重要原因之一。病毒是導(dǎo)致擬穴青蟹發(fā)病的一類(lèi)重要病原,而其在宿主體內(nèi)的繁殖需要宿主提供能量和物質(zhì),為了解低氧環(huán)境下病毒病容易爆發(fā)的機(jī)制,本文研究了低氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)對(duì)擬穴青蟹糖代謝途徑中乳酸脫氫酶(SpLDH)、磷酸果糖激酶(SpPFK)和果糖-1,6-二磷酸激酶(SpFBP)的調(diào)控作用以及對(duì)青蟹體內(nèi)病毒繁殖的影響;另外,還克隆了擬穴青蟹c-型溶菌酶(SplyzC)全長(zhǎng),研究了其組織分布和生物學(xué)功能。具體研究成果如下:(1)克隆了擬穴青蟹SpLDH、SpPFK和SpFBP cDNA基因全長(zhǎng),序列分析結(jié)果顯示:SpLDH cDNA序列全長(zhǎng)1453 bp,開(kāi)放閱讀框包含996 bp核苷酸,編碼332個(gè)氨基酸,蛋白理論分子量36 kDa,理論等電點(diǎn)為7.63,序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)與夏威夷紅蝦(Halocaridina rubra)LDH相似性最高,為89%;SpPFK基因cDNA序列全長(zhǎng)為3634 bp,開(kāi)放閱讀框包含2859 bp核苷酸,編碼953個(gè)氨基酸,蛋白理論分子量105.66 kDa,理論等電點(diǎn)5.76,序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)與克氏螯蝦(Procambarus clarkii)PFK相似性最高,為83%;SpFBP基因cDNA序列全長(zhǎng)1445bp,開(kāi)放閱讀框包含1005 bp核苷酸,編碼335個(gè)氨基酸,蛋白理論分子量36.17kDa,理論等電點(diǎn)6.45,序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)與中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)FBP相似性最高,為92%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)SpLDH、SpPFK和SpFBP在擬穴青蟹各個(gè)組織中均有表達(dá),其中:SpLDH在血細(xì)胞中表達(dá)量最高,鰓和心臟次之,黏膜中表達(dá)量最低;SpPFK在鰓中表達(dá)量最高,血細(xì)胞和肌肉中次之,黏膜中最少;SpFBP在肝胰腺中表達(dá)量最高,心臟和胃中次之,肌肉中最少。注射dsRNA-HIF-1α(簡(jiǎn)稱(chēng)dsHIF-1α)后被檢測(cè)組織中的SpLDH、SpPFK和SpFBP表達(dá)均顯著下調(diào)。在低氧狀態(tài)下:SpLDH表達(dá)量在鰓中最高,其次是心臟和血細(xì)胞,腸和黏膜中最低;SpPFK在鰓和心臟中表達(dá)量較高,血細(xì)胞肌肉和胃中次之;SpFBP在肝胰腺、心臟和黏膜中表達(dá)量較高,鰓、胃和腸中次之。常氧和低氧狀態(tài)下,SpLDH和SpPFK在檢測(cè)組織中表達(dá)量均上調(diào),SpFBP除了在血細(xì)胞中表達(dá)量下調(diào)外在其余檢測(cè)組織中也都表現(xiàn)為上調(diào)。干擾HIF-1α的表達(dá)后,在低氧環(huán)境下SpLDH、SpPFK和SpFBP表達(dá)以及LDH活性和乳酸堆積量同有氧環(huán)境相比沒(méi)有發(fā)生顯著變化。感染青蟹雙順?lè)醋硬《?Mud Crab Dicistrovirus-1,MCDV-1)后,SpLDH、SpPFK和SpFBP表達(dá)都不同程度上調(diào)。干擾HIF-1α的表達(dá)后,人工感染MCDV-1,擬穴青蟹SpLDH、SpPFK和SpFBP表達(dá)量和LDH活性相對(duì)于直接人工感染病毒變化降低,葡萄糖和乳酸含量也會(huì)降低且病毒拷貝數(shù)和死亡率都會(huì)大幅度下降。(2)擬穴青蟹SplyzC基因全長(zhǎng)849 bp,開(kāi)放閱讀框包含669 bp核苷酸,編碼223個(gè)氨基酸的蛋白,蛋白理論分子量為23.7 kDa,理論等電點(diǎn)為8.90。序列比對(duì)結(jié)果顯示SpLyzC與來(lái)自其他甲殼動(dòng)物的c-型溶菌酶相似性?xún)H為23%-68%,但溶菌酶活性位點(diǎn)高度保守;SplyzC可以在所有檢測(cè)組織中檢測(cè)到,在肝胰腺組織中表達(dá)水平最高。副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和MCDV-1感染都可導(dǎo)致擬穴青蟹肝胰腺和鰓組織中SplyzC表達(dá)上調(diào)。重組蛋白rSpLyzC在體外對(duì)溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、金黃色葡萄球菌、哈維弧菌(Vibrio harveyi)和副溶血弧菌均具有抗菌活性。注射SpLyzC的雙鏈RNA干擾SpLyzC表達(dá)后人工感染副溶血性弧菌,擬穴青蟹血淋巴中細(xì)菌的濃度和擬穴青蟹的死亡率均升高;干擾SpLyzC表達(dá)后感染MCDV-1,擬穴青蟹被檢測(cè)組織中病毒拷貝數(shù)和死亡率均升高。綜上所述,低氧脅迫和MCDV-1感染可引起SpLDH、SpPFK和SpFBP的表達(dá)上調(diào),HIF-1可以調(diào)控SpLDH、SpPFK和SpFBP的表達(dá)及MCDV-1在擬穴青蟹體內(nèi)的繁殖,從而降低該病毒感染導(dǎo)致的死亡;SpLyzC可在擬穴青蟹多個(gè)組織中表達(dá),具有廣譜的抗菌活性,對(duì)病毒的侵染也有一定的抵抗作用。
【圖文】：

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文代謝研究進(jìn)展糖代謝的分類(lèi)代謝一般指葡萄糖和糖原等在體內(nèi)的一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)[49]，機(jī)體內(nèi)途徑主要有葡萄糖的無(wú)氧酵解、有氧氧化和糖異生等代謝途徑[50]。糖代謝的調(diào)控和應(yīng)用0 世紀(jì) 20 年代，Heinrich Warburg 首次注意到癌癥細(xì)胞的糖酵解程度異常

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文因此他認(rèn)為改變葡萄糖代謝是癌細(xì)胞在異常條件下維持生存的關(guān)鍵因素象后來(lái)稱(chēng)為 Warburg 效應(yīng)（圖 1-1）[51]。對(duì)于三羧酸循環(huán)，糖酵解產(chǎn)能效率低，但它能為腫瘤細(xì)胞快速提供 ATP供許多大分子物質(zhì)，滿(mǎn)足腫瘤細(xì)胞對(duì)于能量和代謝底物的需求[52]，且糖的大量乳酸為腫瘤細(xì)胞提供了一個(gè)酸性環(huán)境，滿(mǎn)足腫瘤細(xì)胞對(duì)環(huán)境的要瘤細(xì)胞通過(guò)有氧糖酵解代謝為其自身代謝提供需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此研調(diào)控可以為靶向能量代謝治療腫瘤提供參考[54]。葡萄糖是分布最廣、在直接參與新陳代謝且維持生命活動(dòng)最不可缺少的一種單糖[55]，葡萄糖進(jìn)，通過(guò)糖酵解和有氧氧化等過(guò)程產(chǎn)生能量，供給腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖[56是糖酵解途徑的終產(chǎn)物，在缺氧條件下，，可被乳酸脫氫酶 LDH 催化成乳前已發(fā)現(xiàn)的 LDH 抑制劑均有一定的抗腫瘤效應(yīng)，抑制 LDH 活
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S945

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本文編號(hào)：2677555