【摘要】：體腔細胞作為刺參主要的免疫反應效應器,在抵御外界異物入侵等免疫反應中充當了關鍵角色。刺參具有排臟和再生的特殊免疫防御機制,排臟雖然不會導致刺參的直接死亡,但會妨礙刺參的生長發(fā)育速度,同時由于大量體腔液和體腔細胞的排出導致刺參暫時失去了主要的免疫防御屏障而更易受到病原的侵染。目前,針對刺參排臟后的研究更多的關注于消化道等內臟的再生過程及再生機制,對于排臟后體腔細胞的恢復過程知之甚少,對排臟后刺參的免疫響應及免疫防御屏障的重構機制更是鮮為人知。本文利用組織學觀察、單抗示蹤、造血轉錄因子檢測和EdU細胞增殖實驗等技術定位了刺參的“造血組織”,明確了體腔細胞來源;利用細胞計數(shù)、免疫酶學檢測和熒光定量PCR等技術研究了刺參排臟后體腔細胞的恢復規(guī)律和排臟后的免疫反應,為解析刺參體腔細胞的發(fā)生機制和生物的免疫系統(tǒng)進化提供了思路,同時也為進一步研究刺參排臟后免疫防御屏障的重構機制奠定了基礎。刺參的“造血組織”定位。本文利用組織切片技術,觀察了刺參呼吸樹、異網(wǎng)、波里氏囊和體腔上皮的結構特征。利用人造血轉錄因子GATA1抗體通過Western-blot技術發(fā)現(xiàn)刺參體腔細胞、呼吸樹、異網(wǎng)和波里氏囊中分別存在兩條大小為90 kDa和43 kDa的GATA1造血轉錄因子同系物;通過免疫熒光技術檢測到體腔細胞、異網(wǎng)和呼吸樹管腔、波里氏囊的囊壁上含有大量的GATA1陽性信號,但體腔上皮上未發(fā)現(xiàn)任何信號。利用抗刺參體腔細胞單抗(mAb 3F6)示蹤技術發(fā)現(xiàn)在異網(wǎng)和呼吸樹管腔、波里氏囊的囊壁以及體腔上皮的細胞腔隙中上都存在大量的體腔細胞陽性信號。利用細胞EdU增殖技術發(fā)現(xiàn)異網(wǎng)、呼吸樹和波里氏囊上存在強烈的陽性信號,體腔上皮無增殖信號。綜合上述實驗結果,我們分析認為異網(wǎng)、呼吸樹和波里氏囊是刺參的“造血組織”。刺參排臟后體腔細胞的恢復規(guī)律。刺參排臟后體腔細胞和體腔液近乎被排盡,隨著內臟再生的同時,體腔液和體腔細胞也會逐步恢復。通過顯微計數(shù)結果顯示,刺參排臟后,體腔液容積在2 h就能恢復到排臟前水平,總體腔細胞數(shù)量在排臟后6 h到達峰值,之后下降,隨后又上升,期間略有波動,但在排臟后35 d可以恢復到排臟前水平。不同類型體腔細胞數(shù)量的變化與總體腔細胞數(shù)量變化總體趨勢一致,不同類型之間略有差異,實驗結束時,僅有變形細胞和桑椹細胞的個數(shù)恢復到排臟前水平。DNA增殖實驗顯示,排臟前EdU陽性細胞在占總體腔細胞的9.5%,排臟后6 h占4.7%,在排臟后第3 d達到一個最大值,為18.6%,之后出現(xiàn)下降趨勢。因此,我們分析認為排臟后6 h體腔細胞的快速增加可能是由于體腔細胞從水管系統(tǒng)遷移到體腔的結果。刺參排臟后的免疫反應。本實驗室前期研究表明刺參體腔內和波里氏囊內的體腔細胞雖然種類相同,但其體腔細胞數(shù)量和不同類型體腔細胞所占比例存在較大差異;另外,在刺參排臟時波里氏囊不會被排出。本文首先對健康刺參體腔內和波里氏囊內體腔液及體腔細胞從免疫功能上進行了比較,發(fā)現(xiàn)這兩個部位在免疫酶活力和免疫相關基因表達方面都存在較大差異。因此,本文聚焦于刺參這兩個部位進一步進行了刺參排臟后早期的免疫反應研究。結果顯示,刺參排臟后隨時間的推移,體腔內和波里氏囊內體腔液上清中的ACP、AKP、CAT及SOD都呈現(xiàn)先下降后逐漸恢復的變化趨勢。體腔內ACP和AKP在排臟后7 d恢復至排臟前水平,CAT和SOD在排臟后7 d不能恢復至排臟前水平;波里氏囊內ACP和AKP呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢,在第36 h達到峰值,在排臟后第7 d未恢復至排臟前水平;CAT和SOD的酶活力在排臟后7 d呈現(xiàn)先上升后下降在逐漸恢復的趨勢。排臟后,6個免疫基因在體腔內體腔細胞中保持一個較低的表達量。除Aj-iLys外,其他基因在排臟后第3 d都到達一個峰值。體腔中AjTLR3和AjToll的mRNA表達量在排臟后第3 d分別顯著上調了1.8倍和14倍;AjAP,AjMKK3/6,AjToll和AjTLR3在波里氏囊內體腔細胞的表達量呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢,且在排臟后第7 d到達一個峰值。然而AjC3-2和Aj-iLys在排臟后5 d內都沒有顯著的變化差異,但在排臟后第7 d分別顯著上調了15.0倍和4.45倍。以上結果表明,異網(wǎng)、呼吸樹和波里氏囊是刺參的“造血組織”;刺參排臟后體腔細胞近乎排盡,在排臟后6 h體腔細胞數(shù)量急劇增加,之后呈現(xiàn)一定波動,在排臟后35 d可以恢復至排臟前水平;健康刺參體腔內和波里氏囊內體腔液中的非特異性免疫因子存在顯著差異。排臟后,兩個組織中的免疫反應也是不同的,其中波里氏囊內體腔液上清的酶活在恢復過程中出現(xiàn)一個短暫的峰值。此外,體腔內體腔細胞的免疫基因的表達峰值早于波里氏囊內體腔細胞的表達峰值。
【圖文】：

體腔細胞在異網(wǎng)、呼吸樹、波里氏囊和體腔上皮中的分

2.3.5 刺參體腔細胞和“造血組織”中的增殖變化我們在刺參注射 EdU 24 h 后對刺參體腔細胞和“造血組織”中 DNA 的復制情況進行了檢測（圖 2-5）。結果顯示，體腔細胞中存在少量的增殖細胞，大約為總體腔細胞的9.5%。在異網(wǎng)和呼吸樹的管壁中分布著很強烈的 EdU 陽性信號，在波里氏囊的囊壁中也分布著大量的 EdU 陽性信號，而對于體腔上皮，，其上幾乎檢測不到任何增殖的信號。
【學位授予單位】：大連海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2677392