【摘要】：體腔細(xì)胞作為刺參主要的免疫反應(yīng)效應(yīng)器,在抵御外界異物入侵等免疫反應(yīng)中充當(dāng)了關(guān)鍵角色。刺參具有排臟和再生的特殊免疫防御機(jī)制,排臟雖然不會(huì)導(dǎo)致刺參的直接死亡,但會(huì)妨礙刺參的生長(zhǎng)發(fā)育速度,同時(shí)由于大量體腔液和體腔細(xì)胞的排出導(dǎo)致刺參暫時(shí)失去了主要的免疫防御屏障而更易受到病原的侵染。目前,針對(duì)刺參排臟后的研究更多的關(guān)注于消化道等內(nèi)臟的再生過(guò)程及再生機(jī)制,對(duì)于排臟后體腔細(xì)胞的恢復(fù)過(guò)程知之甚少,對(duì)排臟后刺參的免疫響應(yīng)及免疫防御屏障的重構(gòu)機(jī)制更是鮮為人知。本文利用組織學(xué)觀察、單抗示蹤、造血轉(zhuǎn)錄因子檢測(cè)和EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)等技術(shù)定位了刺參的“造血組織”,明確了體腔細(xì)胞來(lái)源;利用細(xì)胞計(jì)數(shù)、免疫酶學(xué)檢測(cè)和熒光定量PCR等技術(shù)研究了刺參排臟后體腔細(xì)胞的恢復(fù)規(guī)律和排臟后的免疫反應(yīng),為解析刺參體腔細(xì)胞的發(fā)生機(jī)制和生物的免疫系統(tǒng)進(jìn)化提供了思路,同時(shí)也為進(jìn)一步研究刺參排臟后免疫防御屏障的重構(gòu)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。刺參的“造血組織”定位。本文利用組織切片技術(shù),觀察了刺參呼吸樹(shù)、異網(wǎng)、波里氏囊和體腔上皮的結(jié)構(gòu)特征。利用人造血轉(zhuǎn)錄因子GATA1抗體通過(guò)Western-blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)刺參體腔細(xì)胞、呼吸樹(shù)、異網(wǎng)和波里氏囊中分別存在兩條大小為90 kDa和43 kDa的GATA1造血轉(zhuǎn)錄因子同系物;通過(guò)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)到體腔細(xì)胞、異網(wǎng)和呼吸樹(shù)管腔、波里氏囊的囊壁上含有大量的GATA1陽(yáng)性信號(hào),但體腔上皮上未發(fā)現(xiàn)任何信號(hào)。利用抗刺參體腔細(xì)胞單抗(mAb 3F6)示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)在異網(wǎng)和呼吸樹(shù)管腔、波里氏囊的囊壁以及體腔上皮的細(xì)胞腔隙中上都存在大量的體腔細(xì)胞陽(yáng)性信號(hào)。利用細(xì)胞EdU增殖技術(shù)發(fā)現(xiàn)異網(wǎng)、呼吸樹(shù)和波里氏囊上存在強(qiáng)烈的陽(yáng)性信號(hào),體腔上皮無(wú)增殖信號(hào)。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們分析認(rèn)為異網(wǎng)、呼吸樹(shù)和波里氏囊是刺參的“造血組織”。刺參排臟后體腔細(xì)胞的恢復(fù)規(guī)律。刺參排臟后體腔細(xì)胞和體腔液近乎被排盡,隨著內(nèi)臟再生的同時(shí),體腔液和體腔細(xì)胞也會(huì)逐步恢復(fù)。通過(guò)顯微計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,刺參排臟后,體腔液容積在2 h就能恢復(fù)到排臟前水平,總體腔細(xì)胞數(shù)量在排臟后6 h到達(dá)峰值,之后下降,隨后又上升,期間略有波動(dòng),但在排臟后35 d可以恢復(fù)到排臟前水平。不同類(lèi)型體腔細(xì)胞數(shù)量的變化與總體腔細(xì)胞數(shù)量變化總體趨勢(shì)一致,不同類(lèi)型之間略有差異,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),僅有變形細(xì)胞和桑椹細(xì)胞的個(gè)數(shù)恢復(fù)到排臟前水平。DNA增殖實(shí)驗(yàn)顯示,排臟前EdU陽(yáng)性細(xì)胞在占總體腔細(xì)胞的9.5%,排臟后6 h占4.7%,在排臟后第3 d達(dá)到一個(gè)最大值,為18.6%,之后出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此,我們分析認(rèn)為排臟后6 h體腔細(xì)胞的快速增加可能是由于體腔細(xì)胞從水管系統(tǒng)遷移到體腔的結(jié)果。刺參排臟后的免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)的體腔細(xì)胞雖然種類(lèi)相同,但其體腔細(xì)胞數(shù)量和不同類(lèi)型體腔細(xì)胞所占比例存在較大差異;另外,在刺參排臟時(shí)波里氏囊不會(huì)被排出。本文首先對(duì)健康刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液及體腔細(xì)胞從免疫功能上進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)部位在免疫酶活力和免疫相關(guān)基因表達(dá)方面都存在較大差異。因此,本文聚焦于刺參這兩個(gè)部位進(jìn)一步進(jìn)行了刺參排臟后早期的免疫反應(yīng)研究。結(jié)果顯示,刺參排臟后隨時(shí)間的推移,體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液上清中的ACP、AKP、CAT及SOD都呈現(xiàn)先下降后逐漸恢復(fù)的變化趨勢(shì)。體腔內(nèi)ACP和AKP在排臟后7 d恢復(fù)至排臟前水平,CAT和SOD在排臟后7 d不能恢復(fù)至排臟前水平;波里氏囊內(nèi)ACP和AKP呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì),在第36 h達(dá)到峰值,在排臟后第7 d未恢復(fù)至排臟前水平;CAT和SOD的酶活力在排臟后7 d呈現(xiàn)先上升后下降在逐漸恢復(fù)的趨勢(shì)。排臟后,6個(gè)免疫基因在體腔內(nèi)體腔細(xì)胞中保持一個(gè)較低的表達(dá)量。除Aj-iLys外,其他基因在排臟后第3 d都到達(dá)一個(gè)峰值。體腔中AjTLR3和AjToll的mRNA表達(dá)量在排臟后第3 d分別顯著上調(diào)了1.8倍和14倍;AjAP,AjMKK3/6,AjToll和AjTLR3在波里氏囊內(nèi)體腔細(xì)胞的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì),且在排臟后第7 d到達(dá)一個(gè)峰值。然而AjC3-2和Aj-iLys在排臟后5 d內(nèi)都沒(méi)有顯著的變化差異,但在排臟后第7 d分別顯著上調(diào)了15.0倍和4.45倍。以上結(jié)果表明,異網(wǎng)、呼吸樹(shù)和波里氏囊是刺參的“造血組織”;刺參排臟后體腔細(xì)胞近乎排盡,在排臟后6 h體腔細(xì)胞數(shù)量急劇增加,之后呈現(xiàn)一定波動(dòng),在排臟后35 d可以恢復(fù)至排臟前水平;健康刺參體腔內(nèi)和波里氏囊內(nèi)體腔液中的非特異性免疫因子存在顯著差異。排臟后,兩個(gè)組織中的免疫反應(yīng)也是不同的,其中波里氏囊內(nèi)體腔液上清的酶活在恢復(fù)過(guò)程中出現(xiàn)一個(gè)短暫的峰值。此外,體腔內(nèi)體腔細(xì)胞的免疫基因的表達(dá)峰值早于波里氏囊內(nèi)體腔細(xì)胞的表達(dá)峰值。
【圖文】：

體腔細(xì)胞在異網(wǎng)、呼吸樹(shù)、波里氏囊和體腔上皮中的分

2.3.5 刺參體腔細(xì)胞和“造血組織”中的增殖變化我們?cè)诖虆⒆⑸?EdU 24 h 后對(duì)刺參體腔細(xì)胞和“造血組織”中 DNA 的復(fù)制情況進(jìn)行了檢測(cè)（圖 2-5）。結(jié)果顯示，體腔細(xì)胞中存在少量的增殖細(xì)胞，大約為總體腔細(xì)胞的9.5%。在異網(wǎng)和呼吸樹(shù)的管壁中分布著很強(qiáng)烈的 EdU 陽(yáng)性信號(hào)，在波里氏囊的囊壁中也分布著大量的 EdU 陽(yáng)性信號(hào)，而對(duì)于體腔上皮，，其上幾乎檢測(cè)不到任何增殖的信號(hào)。
【學(xué)位授予單位】：大連海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2677392