【摘要】：目前有關(guān)蟹類免疫防御的研究大多數(shù)都集中在成體,胚胎如何保護自己免受病原體攻擊這一發(fā)育免疫學(xué)中的關(guān)鍵問題卻鮮有報道。本研究報道了我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖蟹類三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)早期胚胎的免疫功能并探討其免疫機制。實驗表明,三疣梭子蟹受精卵蛋白提取液對革蘭氏陰性菌溶藻弧菌、革蘭氏陽性菌藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌、真菌畢赤酵母菌的生長過程具有明顯的抑制作用,而對革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌和大腸桿菌抑制效果不明顯或無抑制效果。三疣梭子蟹受精卵蛋白提取液對溶藻弧菌、大腸桿菌以及畢赤酵母菌具有明顯的凝集活性和損傷作用,而對銅綠假單胞菌、藤黃微球菌和金黃色葡萄球菌無凝集和損傷作用。酶活實驗表明,溶菌酶和Cu/Zn-SOD的活力隨胚胎發(fā)育時期呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。ELISA實驗結(jié)果表明,補體系統(tǒng)的關(guān)鍵分子C3和C4存在于受精卵中,與以上酶活實驗結(jié)果不同,C3和C4隨胚胎發(fā)育時期呈現(xiàn)先下降后上升趨勢且受精卵和卵裂期含量明顯高于囊胚期,推測其可能是重要的母源免疫分子。補體凝集素途徑的激活需要Ca~(2+)參與,金屬離子螯合實驗顯示,在受精卵蛋白提取液中添加Ca~(2+)螯合劑后,其抑菌活性明顯降低,而補充足量的Ca~(2+)后,其抑菌活性在一定程度上得到了恢復(fù),相反抑制替代途徑再補充其所需的Mg~(2+)不能使抑菌活性得到恢復(fù)。以上研究結(jié)果表明,三疣梭子蟹的受精卵蛋白提取液具有抑菌、凝菌和菌損傷活性,溶菌酶、Cu/Zn-SOD和補體凝集素途徑在早期胚胎的免疫保護中發(fā)揮重要作用。補體凝集素途徑關(guān)鍵分子甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)和纖維膠凝蛋白(ficolin)作為關(guān)鍵的模式識別受體(PRR)在先天免疫反應(yīng)中起重要作用。本研究從三疣梭子蟹中克隆出了一種新的甘露糖結(jié)合凝集素(命名為PtMBL)和新的纖維膠凝蛋白(命名為Ptficolin)。PtMBL基因的cDNA全長為1208bp,開放閱讀框(ORF)長度為732bp,編碼含有244個氨基酸的蛋白質(zhì)。經(jīng)過多序列比對顯示PtMBL與其他物種中的MBL具有較低的氨基酸相似性,但它含有具有QPD基序的保守碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域(CRD)。PtMBL主要在眼柄和鰓中檢測到且經(jīng)溶藻弧菌,藤黃微球菌和畢赤酵母菌刺激后,血細胞中PtMBL被不同程度的激活。重組PtMBL蛋白顯示出針對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抑菌活性并且可以結(jié)合并凝集細菌和真菌(具有Ca~(2+)依賴性)。此外,D-半乳糖和D-甘露糖都可以抑制凝集活性,這表明PtMBL具有更廣泛的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)識別譜。Ptficolin基因的cDNA全長為2183bp,開放閱讀框(ORF)長度為963bp,編碼含有321個氨基酸的蛋白質(zhì)。經(jīng)過多序列比對顯示Ptficolin與其他無脊椎動物中的ficolin具有較低的氨基酸相似性,但與其他已經(jīng)鑒定出的無脊椎動物的ficolin具有保守的信號肽和FBG結(jié)構(gòu)域。Ptficolin主要在肝胰腺、眼柄和胸神經(jīng)節(jié)中檢測到且用經(jīng)過溶藻弧菌,藤黃微球菌和畢赤酵母菌刺激后,血細胞中Ptficolin可產(chǎn)生快速響應(yīng)。這些結(jié)果共同表明,PtMBL和Ptficolin不僅可以作為免疫識別中的模式識別受體,而且可以作為蟹類的先天免疫反應(yīng)中潛在的抗菌蛋白發(fā)揮作用。
【圖文】：

圖 1.1 凝集素激活途徑（Mihaela 等.，2001）Fig.1.1 Lectin pathway (Mihaela 等.，2001)1.2.3 無脊椎動物補體系統(tǒng)研究進展

第 2 章 三疣梭子蟹早期胚胎免疫及補體功能研究2.1.3.2 受精卵蛋白提取液對微生物生長的抑制作用通過測量菌液生長不同時間的 OD 值發(fā)現(xiàn)三疣梭子蟹受精卵蛋白提取液對不同菌種的生長具有不同程度的抑制作用（圖 2.2）。 實驗結(jié)果表明，三疣梭子蟹的受精卵蛋白提取液對溶藻弧菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌和畢赤酵母菌的生長有不同程度的抑制作用（圖 2.2A，，D，E 和 F），且抑制程度與受精卵蛋白提取液濃度呈正相關(guān)，添加初始濃度（14.3mg/ml）的受精卵蛋白提取液比稀釋 5 倍的（濃度 2.86mg/ml）具有更強的抑菌能力，能夠顯著的抑制菌的生長。且不同濃度的受精卵蛋白提取液對于微生物的生長抑制作用均顯著高于 PBS 對照組。然而，受精卵蛋白提取液對于大腸桿菌和銅綠假單胞菌的生長幾乎無抑制作用（圖 2.2B，C）。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4

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