【摘要】：嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila),是引起淡水魚敗血癥的主要病原,也可引起人類感染發(fā)病,是一種人-畜-魚共患的致病微生物。該菌致病機(jī)制復(fù)雜,迄今為止還有許多未知毒力因子尚未發(fā)現(xiàn)。全面鑒定嗜水氣單胞菌毒力基因?qū)⒂兄谌藗儗?duì)該病原菌的分子致病機(jī)制有更加深入的認(rèn)識(shí),為控制和預(yù)防該菌引發(fā)的傳染病的發(fā)生提供更多手段和途徑。然而,目前嗜水氣單胞菌中國分離株尚未進(jìn)行全基因組測(cè)序,無法全面破譯其遺傳信息,并且缺乏合適的毒力評(píng)估模型,這些都限制了該菌致病機(jī)制的研究。本研究對(duì)嗜水氣單胞菌中國流行株進(jìn)行了全基因組測(cè)序分析,鑒定出流行株所特有的3條代謝途徑,確定了 ST251型菌株為中國和美國地區(qū)的主要流行株,并建立了以四膜蟲為模型評(píng)估氣單胞菌毒力的方法,利用轉(zhuǎn)座子插入突變技術(shù)結(jié)合四膜蟲模型,篩選出新的毒力相關(guān)基因。研究結(jié)果不僅豐富了對(duì)嗜水氣單胞菌致病機(jī)制的認(rèn)識(shí),同時(shí)也為毒力菌株的高通量篩選探索了一條新途徑。1.嗜水氣單胞菌全基因組測(cè)序及比較基因組學(xué)研究首次對(duì)分離自不同年代的嗜水氣單胞菌中國流行株NJ-35和J-1進(jìn)行了全基因組測(cè)序,并與已公布的嗜水氣單胞菌的基因組進(jìn)行了比較基因組學(xué)研究。研究結(jié)果表明,中國流行株和美國流行株的親緣關(guān)系很近,其基因組具有高度的相似性,均屬于ST251型菌株。對(duì)流行株和環(huán)境分離株毒力因子的分析結(jié)果表明,已知的毒力因子如Ⅲ型分泌系統(tǒng)、Ⅵ型分泌系統(tǒng)以及側(cè)生鞭毛系統(tǒng)等并不是ST251型流行株所必需的毒力因子。另外,本研究鑒定出了包括前噬菌體、O抗原等27個(gè)基因組適應(yīng)性區(qū)域,其中編碼肌醇、唾液酸以及L-巖藻糖等3條代謝途徑的基因區(qū)域只存在于ST251型流行株中,表明這三條代謝途徑有可能是流行株與環(huán)境分離株之間的毒力差異之所在。該研究對(duì)嗜水氣單胞菌的遺傳信息進(jìn)行了全面的破譯,為其致病機(jī)制的研究提供了豐富的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)及新的見解。2.ST251型菌株的地理分布及致病生物學(xué)特性分析對(duì)ST251型菌株的分離地點(diǎn)和來源進(jìn)行了溯源,確定了 ST251型菌株即為中國和美國地區(qū)的主要流行株。對(duì)30株嗜水氣單胞菌毒力的分析結(jié)果表明,ST251型菌株均為有毒株。毒力因子的分析結(jié)果表明,所有菌株包括ST251型等有毒株均不含有Ⅲ型分泌系統(tǒng)及側(cè)生鞭毛系統(tǒng),說明這兩種毒力因子并不是ST251型等強(qiáng)毒株發(fā)揮致病性所必需的毒力因子,而Ⅱ性分泌系統(tǒng)在所有菌株中均保守存在,說明該分泌系統(tǒng)對(duì)于細(xì)菌胞外產(chǎn)物的分泌是足夠且必需的,但其不能作為細(xì)菌毒力的判定標(biāo)識(shí)。對(duì)ST251型菌株的致病特性分析表明,ST251型菌株與其他ST型菌株在生物被膜形成能力、運(yùn)動(dòng)能力、胞外產(chǎn)物的溶血活性及蛋白酶活性等方面并不存在規(guī)律性差異,但是它們可以利用肌醇、唾液酸和L-巖藻糖來進(jìn)行生長,并且在小鼠體內(nèi)的存活能力更強(qiáng),表明其所含有的肌醇、唾液酸和L-巖藻糖等代謝途徑可能會(huì)有助于細(xì)菌在宿主體內(nèi)獲得營養(yǎng)物質(zhì),增強(qiáng)細(xì)菌在宿主體內(nèi)的生存和增殖能力,從而使得該序列型菌株能夠成為強(qiáng)毒力菌株,并廣泛流行。3.氣單胞菌毒力評(píng)估模型的建立對(duì)以四膜蟲作為模型宿主評(píng)估氣單胞菌毒力的可行性進(jìn)行分析,分析結(jié)果表明:四膜蟲與氣單胞菌共培養(yǎng)后,菌株的相對(duì)存活率與該菌株對(duì)斑馬魚的半數(shù)致死量(LD50)呈負(fù)相關(guān),皮爾遜相關(guān)系數(shù)為-0.683(P0.01);而四膜蟲的相對(duì)存活率與該菌株對(duì)斑馬魚的LD50呈正相關(guān),皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.743(P0.01)。經(jīng)分析確定:如以細(xì)菌的相對(duì)存活率為判定依據(jù),則相對(duì)存活率高于60%時(shí),可判定該菌株為有毒株;低于40%時(shí),判定為無毒株;如以四膜蟲的相對(duì)存活率為判定依據(jù),當(dāng)四膜蟲相對(duì)存活率低于40%時(shí),判定該菌株為有毒株,而高于50%時(shí),判定為無毒株。總體而言,我們成功建立了以四膜蟲為模型宿主評(píng)估氣單胞菌毒力的方法,為評(píng)估氣單胞菌毒力提供了一條可靠、簡(jiǎn)單的途徑4.嗜水氣單胞菌突變體庫的建立及毒力相關(guān)基因的篩選以ST251型嗜水氣單胞菌流行株NJ-35為親本株,利用轉(zhuǎn)座子插入突變技術(shù)建立了含有1030株插入突變株的突變體庫,并以四膜蟲為模型篩選到了 94株毒力顯著減弱的突變株,然后以斑馬魚為模型對(duì)其中毒力降低最明顯的36株突變株的毒力再次進(jìn)行評(píng)估,鑒定出了 33株半數(shù)致死量上升1個(gè)數(shù)量級(jí)以上的突變株,最終鑒定出了19個(gè)轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn),其中7個(gè)插入位點(diǎn)位于非編碼區(qū)域,12個(gè)插入位點(diǎn)位于編碼區(qū)域,這些被插入失活的基因主要編碼菌毛基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子(transcriptional regulator)、位于O抗原基因簇的葡萄糖-1-磷酸胸苷轉(zhuǎn)移酶(glucose-1-phosphate thymidylyltransferase,RmlA)、幾丁質(zhì)酶(chitinase A,ChiA)、機(jī)械敏感性離子通道蛋白(mechanosensitive ion channel protein)以及鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)子(potassium transporter,TrkH)等。對(duì)插入突變株的致病生物學(xué)特性分析表明,不同突變株對(duì)四膜蟲、斑馬魚以及HEp-2細(xì)胞的毒力都有所降低,但各突變株在生長能力、運(yùn)動(dòng)能力等其他生物學(xué)特性上的表型并不一致。該研究鑒定出了 12個(gè)嗜水氣單胞菌的毒力相關(guān)基因,加深了對(duì)該病原菌致病機(jī)制的了解,為該菌致病機(jī)制的研究提供了科學(xué)依據(jù)。5.嗜水氣單胞菌chiA和trkH基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性分析針對(duì)插入突變技術(shù)篩選到的基因chiA和trkH,為了探討其功能,采用同源重組技術(shù),以ST251型嗜水氣單胞菌NJ-35為親本株,以pYAK1為自殺性質(zhì)粒構(gòu)建了chiA和trkH的基因缺失株,并以穿梭質(zhì)粒pMMB207構(gòu)建了相應(yīng)的互補(bǔ)株。對(duì)缺失株、互補(bǔ)株和野生株的生物學(xué)特性研究表明,chiA基因缺失后,其生長能力、運(yùn)動(dòng)能力沒有改變,但是其對(duì)四膜蟲、斑馬魚以及HEp2細(xì)胞的毒力顯著降低,其胞外產(chǎn)物的溶血活性和蛋白酶活性稍有降低,另外其在小鼠體內(nèi)的存活能力也顯著下降;trkH基因缺失后,其生長能力、運(yùn)動(dòng)能力沒有改變,但是其對(duì)四膜蟲、斑馬魚以及HEp-2細(xì)胞的毒力顯著降低,并且其降低程度要大于chiA基因的缺失株,其胞外產(chǎn)物的溶血活性和蛋白酶活性也稍有降低,另外其在小鼠體內(nèi)的存活能力也顯著下降。本研究說明chiA和trkH兩個(gè)基因在嗜水氣單胞菌感染宿主的過程中起著重要的作用,可能是該病原菌發(fā)揮致病作用所必需的基因,但是其發(fā)揮作用的具體機(jī)制仍需后續(xù)的研究。
【圖文】：

從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞外環(huán)境的跨膜運(yùn)輸，，而送些蛋白大部分都與細(xì)胞損傷、組織病變相關(guān)逡逑［ｉｓ］。如圖１－１所示，嗜水氣單胞菌ＡＴＣＣ邋７９６６Ｔ的Ｔ２ＳＳ由ｅｊｃｅＣ－＃操縱子、ｅｘｅNB８及逡逑崎７公所編碼，其中ｅｘｅＣ－ｉＶ操級(jí)子由１２個(gè)基因串聯(lián)在一起}D成，而公及崎ｘＤ則逡逑存在于染色體上的其它位置。逡逑２逡逑

但是細(xì)胞系不能提供生物個(gè)體整體的信息，并且也存在沒有合適的細(xì)胞系，逡逑或者細(xì)胞系難Ｗ培養(yǎng)、傳代等問題，因此活體動(dòng)物模型又引起了研究人員的興趣。下逡逑面對(duì)斑馬魚、四膜蟲、秀麗隱桿線蟲Ｗ及盤基網(wǎng)柄菌等低等動(dòng)物模型（見圖１－２）進(jìn)逡逑行簡(jiǎn)要介紹：逡逑３．１巧馬魚逡逑斑馬魚（ｚｅｂｒａｆｉｓｈ）是硬骨魚，與趣魚、金魚同屬貍科，體型短小（一般小于４邋ｃｍ），逡逑屬淡水魚類，易大規(guī)模養(yǎng)殖�；蚪M初步分析顯示斑馬魚與哺乳動(dòng)物有很多同源基因逡逑甚至是保守基因ｔｗｉ，可Ｗ作為低等動(dòng)物和哺乳動(dòng)物的連接過渡模型。殺娃氣單胞苗逡逑Ｕｅｒｏｗｏｗｗ邐化／）和金黃色葡萄球菌可誘導(dǎo)斑馬魚應(yīng)急蛋白質(zhì)的表達(dá)１Ｗ１。這逡逑種誘導(dǎo)與在哺乳動(dòng)物中類似，說明魚和哺乳動(dòng)物之間的免疫機(jī)理具有保守性。Ｒｏｊｏ等逡逑ＩＷ發(fā)現(xiàn)腹腔注射媛弧菌使成年斑馬魚表達(dá)炎癥和免疫應(yīng)答的相逡逑關(guān)基因。另外，斑馬魚也被用來研究表皮葡萄球菌（Ｓ邸抑／ｏｃｏｃｃｗｅ如＆／７Ｗ’施■）感染逡逑宿主的致病機(jī)制Ｗ上研究表明斑馬魚可Ｗ作為一種模型來評(píng)估細(xì)菌毒力，并且該逡逑模型的使用可Ｗ使研究人員能夠洞察免疫系統(tǒng)的作用和發(fā)育＾心及病原體和宿主之間逡逑的反應(yīng)。目前，斑馬魚己經(jīng)成為研究魚類傳染病的發(fā)病機(jī)理和免疫應(yīng)答等基礎(chǔ)研究的逡逑最合適的模型系統(tǒng)。逡逑３．２四膜蟲逡逑四膜蟲是一種營自由生活的單細(xì)胞真核生物
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S941.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2663591