【摘要】：維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii,AV)是多數(shù)水生動(dòng)物的病原菌之一,在某些條件下也可引起人類(lèi)感染發(fā)病。因此,研發(fā)新型重組疫苗可有效的降低養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。由于抗生素耐藥性及感染魚(yú)類(lèi)后可快速傳播等問(wèn)題,在水產(chǎn)養(yǎng)殖中接種疫苗仍是最有效的預(yù)防細(xì)菌感染魚(yú)類(lèi)的方式之一。在與細(xì)菌毒力相關(guān)的多種毒力因子中,由于外膜蛋白(outer membrane protein)暴露于菌體表面且與細(xì)菌致病性密切相關(guān),被廣泛地應(yīng)用于疫苗開(kāi)發(fā)研究中。本文以維氏氣單胞菌TH0426為研究對(duì)象,通過(guò)質(zhì)譜分析對(duì)該菌株具有潛在性的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。首先,將滅活的維氏氣單胞菌與佐劑混合后免疫健康鯉魚(yú),間隔2周免疫一次,在第二次加強(qiáng)免疫后采集血清。結(jié)果顯示,經(jīng)SDS-PAGE與Western blot檢測(cè)該菌株具有多種具有免疫原性的蛋白質(zhì);此外,通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定出39個(gè)具有反應(yīng)原性的蛋白質(zhì),其分子量范圍在102.83-25.09 kDa之間。其次,在質(zhì)譜分析鑒定的基礎(chǔ)上,對(duì)維氏氣單胞菌TH0426株的OmpF基因進(jìn)行了擴(kuò)增、克隆及測(cè)序分析,利用分子生物學(xué)技術(shù),構(gòu)建了表達(dá)A.veronii TH0426 OmpF基因的原核表達(dá)載體。此外,利用乳糖操縱子啟動(dòng)的大腸桿菌/乳酸菌穿梭表達(dá)載體p PG612表達(dá)OmpF基因,以鯉魚(yú)腸源干酪乳桿菌作為表達(dá)外源基因的遞呈載體,并通過(guò)SDS-PAGE與Western blot進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,經(jīng)PCR擴(kuò)增克隆出Omp F基因并成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒p PG612-OmpF,此株重組乳桿菌表達(dá)約45 kDa蛋白且具有良好的反應(yīng)原性。為評(píng)估構(gòu)建的重組乳桿菌L.casei/pPG612-OmpF的免疫保護(hù)效果及有效誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力,本研究應(yīng)用重組乳桿菌口服免疫鯽魚(yú),并進(jìn)行攻毒保護(hù)性試驗(yàn)。將重組菌L.casei/pPG612-OmpF經(jīng)乳糖誘導(dǎo)后包被于顆粒餌料免疫鯽魚(yú),每隔2周免疫一次,共免疫3次,每次連續(xù)免疫3 d。在免疫前與免疫后第1、7、12、17、21、31及38 d采集血清樣品和臟器組織樣品,檢測(cè)血清及組織中相關(guān)免疫指標(biāo)的變化;在免疫前與免疫后第1、3、5、7、12、16及20 d收集鯽魚(yú)腸道清洗液,檢測(cè)重組乳桿菌在鯽魚(yú)腸道定植情況。采用ELISA方法分別檢測(cè)免疫鯽魚(yú)血清中IgM、Ig T、IL-8及IFN-γ含量。結(jié)果表明,重組乳桿菌L.casei/pPG612-OmpF能在前腸中有效定植數(shù)天,在免疫7天后前腸中菌落數(shù)處于最高水平,且定植數(shù)量高于中腸和后腸;經(jīng)ELISA法檢測(cè)免疫前后不同時(shí)間血清中IgM含量,結(jié)果顯示免疫重組乳桿菌L.casei/pPG612-Omp F的鯽魚(yú)在加強(qiáng)與再次加強(qiáng)免疫后產(chǎn)生較高的IgM水平;此外,血清中相關(guān)細(xì)胞因子IgT、IL-8及IFN-γ的表達(dá)水平在加強(qiáng)免疫后處于上調(diào)趨勢(shì),與對(duì)照組差異顯著,初步說(shuō)明重組菌可增強(qiáng)鯽魚(yú)的體液免疫。最后,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)鯽魚(yú)不同組織中免疫相關(guān)基因(IL-1β,IL-10,TNF-α,IFNγ)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,免疫重組乳桿菌L.casei/pPG612-OmpF后,鯽魚(yú)心、肝及頭腎中的IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)量有所提升;重組乳桿菌L.casei/pPG612-OmpF組中IL-10的相對(duì)表達(dá)量在心、肝、脾、頭腎及腸道中呈上調(diào)趨勢(shì);隨著時(shí)間推移,在免疫21天后,心、脾、頭腎及腸道中的TNF-α基因轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)增強(qiáng);在首免5天后,IFNγ的mRNA相對(duì)表達(dá)量在心、肝、脾及頭腎中顯著上升,表明重組乳桿菌分泌的外膜蛋白可能刺激腸道淋巴組織分泌相關(guān)細(xì)胞因子,進(jìn)而提升鯽魚(yú)的免疫反應(yīng)水平。經(jīng)腹腔注射A.veronii TH0426 1.×106CFU/尾,結(jié)果表明,重組乳桿菌L.casei/pPG612-Omp F組鯽魚(yú)的免疫保護(hù)率為51.43%,對(duì)照組鯽魚(yú)全部死亡,免疫重組乳桿菌能減緩A.veronii的感染,具有一定的保護(hù)作用。本研究構(gòu)建了表達(dá)A.veronii TH0426株OmpF基因重組干酪乳桿菌,利用重組乳桿菌免疫鯽魚(yú)后可誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生特異性IgM抗體及體液免疫反應(yīng),可保護(hù)鯽魚(yú)抵抗A.veronii的侵襲及感染。綜上所述,經(jīng)黏膜途徑免疫重組活載體L.casei/pPG612-OmpF是一種潛在抗維氏氣單胞菌感染的疫苗候選。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S941.4
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本文編號(hào)：2649749