發(fā)布時(shí)間：2020-05-05 07:03

【摘要】：水溫作為一種重要的環(huán)境因子,直接或間接地影響魚類的繁殖、發(fā)育、生長(zhǎng)和代謝等生理過(guò)程。當(dāng)前氣候多變,極端天氣的出現(xiàn)經(jīng)常導(dǎo)致水溫突然改變,從而對(duì)魚類產(chǎn)生溫度脅迫,影響其存活和生長(zhǎng),降低魚類養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益,甚至可能造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此,本研究通過(guò)克隆獲得多鱗白甲魚AMPK家族基因的完整CDS,全面分析溫度脅迫下多鱗白甲魚血清和組織中的腺苷酸水平、能量物質(zhì)含量和脂肪酸組成,以及AMPK與其調(diào)控的脂肪酸代謝相關(guān)基因表達(dá)和酶活力的變化,系統(tǒng)研究溫度脅迫下多鱗白甲魚能量穩(wěn)態(tài)及脂肪酸代謝的變化規(guī)律,為闡明魚類對(duì)溫度變化的適應(yīng)策略,以及建立和優(yōu)化緩解溫度脅迫對(duì)魚類不利影響的人工養(yǎng)殖技術(shù)提供理論依據(jù)。試驗(yàn)一多鱗白甲魚AMPK家族基因的克隆及生物信息學(xué)分析。通過(guò)克隆獲得多鱗白甲魚AMPK家族基因的完整CDS,進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),多鱗白甲魚AMPKα1(MG720299.1),AMPKα2(MG720300.1),AMPKβ1(MG720301.1),AMPKβ2(MG720302.1),AMPKγ1(MG720303.1),AMPKγ2(MG720304.1)和AMPKγ3(MG720305.1)分別包含1713 bp,1659 bp,783 bp,801 bp,993 bp,1605 bp和1014 bp的完整CDS,編碼了570,552,260,266,330,534和337個(gè)氨基酸;系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明這些氨基酸序列與鯉科魚類,如鯉、斑馬魚,尤其與我國(guó)特有的渻亞科魚類,如金線渻(Sinocyclocheilus grahami),具有高度的相似性(92.44%~97.95%),結(jié)構(gòu)域均比較保守。此外,多鱗白甲魚AMPK家族7個(gè)基因在心臟、肝臟和肌肉中的mRNA表達(dá)水平均較高,可能與這些組織中比較旺盛的能量代謝十分相關(guān)。試驗(yàn)二低溫脅迫促進(jìn)多鱗白甲魚能量消耗,增強(qiáng)脂肪酸β-氧化,抑制脂肪酸合成,并改變機(jī)體脂肪酸組成。在低溫脅迫(10℃)不同時(shí)間點(diǎn)(0h,1h,3h,6h,12h,24h,48h),檢測(cè)多鱗白甲魚血清以及肝臟、肌肉等樣品中腺苷酸(ATP,ADP,AMP),甘油三酯(TG)、游離脂肪酸(NEFA)、總膽固醇(T-CHO)、葡萄糖(GLU)和總蛋白(TP)的含量,組織脂肪酸組成,肝臟和肌肉中AMPKα以及脂肪酸代謝相關(guān)基因的mRNA表達(dá)及酶活力的變化。結(jié)果顯示,血清和肌肉中AMP/ATP值顯著升高(P0.05),血清和肝臟的AEC值均低于0.75;血清和肝臟中GLU的含量均先升高,然后降低,血清中TG的含量在3h后顯著下降(P0.05),NEFA的含量先升高,3h后逐漸降低,而T-CHO和TP含量變化不顯著,肝臟中NEFA的含量也隨時(shí)間推移逐漸降低;肌肉中單不飽和脂肪酸(MUFA)的比例隨時(shí)間逐漸降低,而n-3系列高不飽和脂肪酸(n-3 HUFA)的比例呈上升趨勢(shì);肝臟中AMPKα2的mRNA表達(dá)水平隨時(shí)間推移逐漸升高,肌肉中AMPKα1和AMPKα2的mRNA表達(dá)水平均在48h顯著升高(P0.05),然而其活力的變化均不顯著,肝臟中ATGL的mRNA表達(dá)水平升高,但無(wú)顯著性差異,ACC2和CPT1A的mRNA表達(dá)水平顯著升高,而肝臟和肌肉中ACC1和FAS的mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P0.05)。研究表明,低溫脅迫(10℃)下,多鱗白甲魚持續(xù)消耗能量,能量穩(wěn)態(tài)失衡,可能激活A(yù)MPK,動(dòng)員能量物質(zhì)代謝尤其增強(qiáng)脂肪酸β-氧化,抑制脂肪酸合成;同時(shí),肌肉中MUFA的比例降低,這可能與其優(yōu)先被氧化供能有關(guān),而n-3HUFA的比例隨時(shí)間推移而增加,這可能與其參與維持膜流動(dòng)性,保證細(xì)胞膜的正常功能相關(guān)。試驗(yàn)三高溫脅迫促進(jìn)多鱗白甲魚脂質(zhì)水解及脂肪酸β-氧化,抑制脂肪酸合成,并影響其脂肪酸組成。在高溫脅迫(30℃)不同時(shí)間點(diǎn)(0h,1h,3h,6h,12h,24h,48h),檢測(cè)多鱗白甲魚肝臟和肌肉等樣品中NEFA的含量和脂肪酸組成以及脂肪酸代謝相關(guān)基因在mRNA水平上的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,高溫脅迫(30℃)下,多鱗白甲魚肝臟和肌肉中的NEFA含量先升高,隨著時(shí)間推移逐漸減少;肌肉中飽和脂肪酸(SFA)的比例在12h顯著降低(P0.05),n-3 HUFA的比例也呈下降趨勢(shì),其中主要是二十二碳六烯酸(DHA)的比例降低;肝臟中ATGL和HSL的mRNA表達(dá)水平升高,同時(shí),CPT1A和PPARα的mRNA表達(dá)水平也顯著升高,而FAS和SREBP-1的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P0.05)。研究表明,高溫脅迫(30℃)促進(jìn)了多鱗白甲魚脂質(zhì)水解并增強(qiáng)脂肪酸β-氧化,抑制脂肪酸合成;此外,肌肉脂肪酸組成也發(fā)生改變,主要表現(xiàn)為n-3 HUFA的比例隨時(shí)間推移而減少。綜上所述,本研究克隆獲得多鱗白甲魚AMPK家族7個(gè)基因的完整CDS,并發(fā)現(xiàn)溫度脅迫下,多鱗白甲魚持續(xù)消耗能量,能量穩(wěn)態(tài)失衡,可能激活A(yù)MPK,進(jìn)而通過(guò)調(diào)控脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)脂質(zhì)水解及脂肪酸β-氧化供能,抑制脂肪酸合成,以減少能量消耗;此外,脂肪酸組成也發(fā)生適應(yīng)性的改變,以避免溫度脅迫對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害。
【圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述1.1 AMPK 與能量穩(wěn)態(tài)1.1.1 AMPK 簡(jiǎn)介腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK），是一個(gè)調(diào)控機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)的重要的異源三聚體蛋白，組成它的亞基有 α、β 和 γ 三種（圖 1-1）（Garcia andShaw 2017）。其中，α 亞基發(fā)揮催化作用，其 N-端是行使功能的核心部位，含有一個(gè)典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域；作為調(diào)節(jié)亞基，β 亞基包含一個(gè)碳水化合物耦聯(lián)結(jié)構(gòu)域（CBM），主要參與調(diào)節(jié)糖代謝；γ 亞基的 C-端含有 4 個(gè)串聯(lián)重復(fù)排列的 CBS框，2 個(gè) CBS 框串聯(lián)在一起，構(gòu)成一個(gè)具有二聚體結(jié)構(gòu)的 Bateman 結(jié)構(gòu)域，主要感知AMP/ATP 比例的變化，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控作用（Hardie et al. 2012; Xiao et al. 2011）。AMPK能感知機(jī)體能量狀態(tài)的變化，并通過(guò)調(diào)控物質(zhì)代謝的多個(gè)環(huán)節(jié)來(lái)維持細(xì)胞能量的供求平衡。

P/ATP 值升高，從而激活 AMPK，并影響機(jī)體能量代謝。一方面，AMPK 可以糖原、脂肪和膽固醇的合成等減少 ATP 的消耗，另一方面，，AMPK 可以通過(guò)酸氧化、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等增加 ATP 的生成（圖 1-2），從而維持機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)。因PK 也被稱為機(jī)體的 “能量感受器”或“能量開關(guān)”（Frederich et al. 2009; Hardmoto 2006; Hardie et al. 2012）。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S917.4

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