發(fā)布時間：2020-05-03 17:41

【摘要】：赤眼鱒(Squaliobarbus curriculus)俗稱野草魚,與草魚同屬雅羅魚亞科,屬于赤眼鱒屬。赤眼鱒具有比草魚更好的抗草魚呼腸弧病毒(Grass carp reovirus,GCRV)入侵的特性,Toll樣受體(Toll Like Receptors,TLRs)是魚類先天性免疫反應中最重要的模式識別受體家族(Pattern recognition receptors,PRRs)。Toll樣受體7(TLR7)和Toll樣受體9(TLR9)基因是TLR7亞家族的主要成員,在抗病毒免疫反應中扮演著重要的角色。(1)通過RACE-PCR技術,克隆了赤眼鱒TLR7基因(ScTLR7)cDNA全長序列,利用生物信息學方法分析其結(jié)構(gòu)特性,采用Real Time qPCR技術比較分析了ScTLR7免疫應答GCRV的表達特性。結(jié)果表明,ScTLR7基因cDNA全長3715 bp,包括開放閱讀框(ORF)3162 bp,編碼1053個氨基酸殘基,5′-非編碼區(qū)(UTR)403 bp和3′-UTR150 bp(GenBank登錄號為KY472228)。推導的蛋白質(zhì)相對分子量為121.70 kD,理論等電點為7.88。通過I-TASSER預測赤眼鱒TLR7蛋白的三級結(jié)構(gòu)顯示,ScTLR7蛋白為典型的馬蹄形結(jié)構(gòu),包括28個α螺旋和26個β折疊。SMART結(jié)構(gòu)域預測結(jié)果顯示:ScTLR7具有TLRs的典型結(jié)構(gòu)特征,由N端的信號肽、15個富亮氨酸結(jié)構(gòu)域(LRRs)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和Toll/白介素-1受體結(jié)構(gòu)域(TIR)組成。TLR7氨基酸的系統(tǒng)進化樹顯示赤眼鱒TLR7與團頭魴TLR7的親緣關系最近,不同物種TLR7 TIR結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對結(jié)果顯示:硬骨魚類TLR7基因的TIR結(jié)構(gòu)域氨基酸序列高度保守,但沒有發(fā)現(xiàn)3個與配體接頭TIR結(jié)構(gòu)域中的3個保守盒子Box1、Box2和Box3。TLR7在赤眼鱒檢測的9個組織中均有表達,其中TLR7在赤眼鱒頭腎、脾臟中的表達量最高,GCRV感染后,TLR7在赤眼鱒、草魚頭腎中不同時間表達水平結(jié)果表明,感染GCRV后TLR7在草魚和赤眼鱒頭腎中的表達模式類似,ScTLR7和CiTLR7的相對表達量都在96 h達到峰值。(2)通過RACE-PCR技術,克隆了赤眼鱒TLR9基因(ScTLR9)cDNA全長序列,利用生物信息學方法分析其結(jié)構(gòu)特性,采用Real Time qPCR技術比較分析了ScTLR9免疫應答GCRV的表達特性。結(jié)果表明:赤眼鱒TLR9基因cDNA全長3687 bp,包括開放閱讀框(ORF)3180 bp,編碼1059個氨基酸殘基,5′-非編碼區(qū)(UTR)128 bp和3′-UTR 379 bp(GenBank登錄號為KU955845)。推導的蛋白質(zhì)相對分子量為121.61 kD,理論等電點為8.91。通過I-TASSER預測赤眼鱒TLR9蛋白的三級結(jié)構(gòu)顯示,ScTLR9蛋白為典型的馬蹄形結(jié)構(gòu),包括22個α螺旋、12個β折疊。SMART結(jié)構(gòu)域預測結(jié)果顯示:ScTLR9由N端的信號肽、16個富亮氨酸結(jié)構(gòu)域(LRRs)、跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和Toll/白介素-1受體結(jié)構(gòu)域(TIR)組成,具有TLRs的典型結(jié)構(gòu)特征。不同物種TLR9氨基酸的系統(tǒng)進化樹顯示赤眼鱒TLR9與草魚TLR9的親緣關系最近,不同物種TLR9 TIR結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對結(jié)果顯示:硬骨魚類TLR9基因的TIR結(jié)構(gòu)域氨基酸序列高度保守,同時ScTLR9的TIR結(jié)構(gòu)域包含三個高度保守的區(qū)域:Box 1(YDAFVVFD)、Box2(LCLEDRDWLPG)和Box 3(FWNNL)。TLR9在赤眼鱒檢測的10個組織中均有表達,其中TLR9在赤眼鱒頭腎、中腎中的表達量最高,GCRV感染后,TLR9在赤眼鱒、草魚頭腎中不同時間表達水平結(jié)果表明,感染GCRV后TLR9在草魚和赤眼鱒頭腎中的表達模式表現(xiàn)出明顯的差異,在應對GCRV時,ScTLR9比CiTLR9的應答時間更短,反應更迅猛,且ScTLR9的相對表達量率先達到峰值,整體相對表達量遠遠高于草魚。(3)通過構(gòu)建赤眼鱒Toll樣受體9基因的原核表達載體,命名為pET-30a(+)TLR9,分別轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)、Rosetta、BL21(DE3)plysS三種宿主菌中進行蛋白表達,經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)BL21(DE3)plysS為最適蛋白表達宿主菌;通過IPTG誘導表達,得到了TLR9的融合蛋白,經(jīng)過誘導表達條件的優(yōu)化,確定最佳誘導條件為0.25mM IPTG,4h,BL21(DE3)plysS;通過對重組融合蛋白的可溶性分析,結(jié)果表明目的蛋白是可溶性的。經(jīng)SDS-PAGE及Western blot分析鑒定表明ScTLR9蛋白大小約為82 kD,與預期結(jié)果相符。以上結(jié)果為深入研究赤眼鱒Toll樣受體9基因的功能奠定了基礎。
【圖文】：

通過普通 PCR 獲得了單一產(chǎn)物（1kb~1.5kbp）（圖2-1：Ⅰ）；以 TLR75′ RACE 為引物，按照 SMARTer RACE 的說明通過 RACE PCR 獲得了目的產(chǎn)物（2.0k～2.5kbp）（圖 2-1：Ⅱ）；以 TLR73′ RACE 為引物，按照 SMARTer

14圖 2-2 ScTLR7cDNA 氨基酸(aa)序列預測結(jié)果Fig.2-2 ScTLR7 cDNA amino acid (aa) sequence prediction results開放閱讀框(ORF)區(qū)域的核酸序列為大寫字母，5′/3′端非編碼區(qū)(UTR)核酸序列為小寫字母。起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TGA)分別用方框標記和星號標記。在所預測的氨基酸序列中，信號肽序列(1-23 aa)用波浪線標記；富亮氨酸結(jié)構(gòu)域(32-66 aa，123-146 aa，200-223 aa，221-240 aa，286-309 aa，336-356 aa，，393-413 aa，521-545 aa，546-572 aa，600-628 aa，654-677 aa，679-695 aa，703-722 aa，751-772 aa，777-800 aa) 、C-端富亮氨酸結(jié)構(gòu)域(788-839 aa)和 Toll/白介素-1 受體結(jié)構(gòu)域(895-1041 aa)用單下劃線標記；。mRNA 不穩(wěn)定信號“attta”和多聚腺苷酸加尾信號“aataaa”用雙下劃線標記The ORF region within the nucleotide sequence was shown in upper cases whereas the5′/3′UTR regions were shown in lower cases.The start codon (ATG) was boxed and the stop
【學位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 馬建社;葉金明;;赤眼鱒大棚增溫早繁技術[J];水產(chǎn)養(yǎng)殖;2016年11期

2 楊凱;高銀愛;袁勇超;李波;成為為;朱思華;孫俊霄;程穎紅;;赤眼鱒耗氧率、排氨率和窒息點的初步研究[J];淡水漁業(yè);2017年05期

3 杰瑞米瓦德;;東江逗釣赤眼鱒[J];垂釣;2018年14期

4 杰里米瓦德;;野水尋魚記——可遇不可求的赤眼鱒[J];垂釣;2017年16期

5 朱紀偉;;赤眼鱒常見病害防治技術[J];漁業(yè)致富指南;2007年11期

6 唐敬書;;提高赤眼鱒養(yǎng)殖效益的關鍵技術[J];內(nèi)陸水產(chǎn);2007年08期

7 李敦岳;張家良;朱云華;;池塘主養(yǎng)赤眼鱒技術[J];內(nèi)陸水產(chǎn);2006年01期

8 錢華,張建;赤眼鱒池塘無公害養(yǎng)成技術[J];水產(chǎn)科技情報;2005年04期

9 劉伯仁;赤眼鱒的養(yǎng)殖技術[J];水產(chǎn)養(yǎng)殖;2005年02期

10 黃夏!廣西百色,楊林!廣西百色;如何垂釣赤眼鱒[J];中國釣魚;1998年05期

相關會議論文 前4條

1 李偉;李迪;劉巧林;肖調(diào)義;周智愚;金生振;;草魚(♀)×赤眼鱒(♂)F_1及其親本肌肉營養(yǎng)成分比較分析[A];2014年中國水產(chǎn)學會學術年會論文摘要集[C];2014年

2 喬慶;劉巧林;肖調(diào)義;鄧亞林;王榮華;黎玉元;何美鳳;;草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F_1的可育性研究[A];2016年中國水產(chǎn)學會學術年會論文摘要集[C];2016年

3 李潮;藍昭軍;趙俊;;基于線粒體控制區(qū)(D-loop)序列的珠江赤眼鱒遺傳多樣性與遺傳分化研究[A];第十三屆全國野生動物生態(tài)與資源保護學術研討會暨第六屆中國西部動物學學術研討會論文摘要集[C];2017年

4 陳方燦;李新輝;李捷;李躍飛;帥方敏;楊計平;;珠江肇慶江段赤眼鱒外源營養(yǎng)期仔、稚魚的異速生長[A];2014年中國水產(chǎn)學會學術年會論文摘要集[C];2014年

相關重要報紙文章 前10條

1 金萬昆;北方地區(qū)池塘健康養(yǎng)殖赤眼鱒[N];中國漁業(yè)報;2008年

2 徐君輝 柳富榮;池養(yǎng)赤眼鱒把握四要點[N];中國漁業(yè)報;2006年

3 徐君輝 柳富榮;池養(yǎng)赤眼鱒 把握四要點[N];湖南科技報;2006年

4 金萬昆;北方地區(qū)池塘健康養(yǎng)殖赤眼鱒[N];中國漁業(yè)報;2008年

5 劉慶營;赤眼鱒養(yǎng)殖技術[N];中國漁業(yè)報;2006年

6 陳吉英;赤眼鱒人工養(yǎng)殖技術[N];農(nóng)民日報;2012年

7 李桂峰;赤眼鱒的養(yǎng)殖技術[N];廣東科技報;2001年

8 金萬昆;北方地區(qū)池塘健康養(yǎng)殖赤眼鱒[N];中國漁業(yè)報;2008年

9 金萬昆;北方地區(qū)池塘健康養(yǎng)殖赤眼鱒[N];中國漁業(yè)報;2008年

10 ;赤眼鱒生態(tài)養(yǎng)殖技術[N];江蘇科技報;2006年

相關博士學位論文 前2條

1 王榮華;赤眼鱒和草魚TLR22的結(jié)構(gòu)差異及應對GCRV感染的表達特性[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2017年

2 彭慧珍;感染GCRV草魚和赤眼鱒miRNA的鑒定與分析[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2014年

相關碩士學位論文 前7條

1 金生振;赤眼鱒Toll樣受體7和9基因的克隆與表達[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2017年

2 鄭惠芳;赤眼鱒魚種飼料中蛋白質(zhì)、脂肪和鈣磷適宜水平的研究[D];廣西大學;2006年

3 劉敏;赤眼鱒Mx基因全長cDNA克隆、表達及轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2013年

4 孫念;草魚(♀)×赤眼鱒(♂)F1及其親本的腸道結(jié)構(gòu)和功能比較研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2015年

5 鄧亞林;赤眼鱒鰭條細胞系的建立及應用研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2016年

6 陳方燦;西江赤眼鱒群體多樣性研究[D];上海海洋大學;2015年

7 李迪;草魚(♀)×赤眼鱒(♂)F_1及其親本的肌肉營養(yǎng)和質(zhì)構(gòu)特性比較研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2016年

本文編號：2647886