【摘要】：草魚呼腸孤病毒(Grass Crap Reovirus,GCRV)引起的草魚出血病(grass carp hemorrhage disease,GCHD)是嚴(yán)重危害我國草魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的一種烈性傳染病,每年可引起大量草魚死亡而導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟損失,被農(nóng)業(yè)部列為二類動物疫病。GCRV基因組由11個分節(jié)段的dsRNA組成,基于病毒基因組序列差異,GCRV總體上可分為3個基因型,近年流行的基因II型是當(dāng)前草魚出血病的主要病原。GCRV 11個基因節(jié)段均編碼相應(yīng)的功能蛋白,但GCRV Ⅱ型各節(jié)段基因編碼蛋白的功能尚缺乏系統(tǒng)研究,前期主要是通過生物信息數(shù)據(jù)庫分析和預(yù)測所得,不同研究者的結(jié)果出入較大,給GCRV Ⅱ型的病毒學(xué)基礎(chǔ)研究、基因工程疫苗的研制等均造成了困擾。本論文利用病毒純化、LC-MS/MS、抗體制備、Western-blot、IFA等技術(shù)及魚體試驗對GCRV Ⅱ型11個基因節(jié)段編碼蛋白進行鑒定及目標(biāo)蛋白進行免疫原性分析,旨在為GCRV Ⅱ型病毒的病原學(xué)基礎(chǔ)研究及基因工程疫苗等防控產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.病毒純化及LC-MS/MS分析:用GSB細胞大量擴增GCRV Ⅱ型病毒,然后采用蔗糖密度梯度離心法進行病毒純化,LC-MS/MS分析純化的GCRV Ⅱ型病毒。結(jié)果顯示,可檢測到其中9個基因節(jié)段編碼蛋白的肽段信號,蛋白豐度由高到低分別為S6、S4、S3、S9、S1、S10、S11、S2、S5基因編碼的蛋白,說明這9個基因節(jié)段編碼蛋白可能為病毒的結(jié)構(gòu)蛋白,且S6、S4基因編碼蛋白可能為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白;而未檢測到S7、S8基因編碼蛋白的肽段信號,這兩個基因節(jié)段編碼蛋白可能為病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白。2.抗體制備及結(jié)構(gòu)蛋白鑒定:實驗室前期已制備并保存了抗S1~S4、S6~S8、S10、S11基因編碼蛋白的抗體;本研究新構(gòu)建了S5、S9基因編碼蛋白的重組原核表達載體,誘導(dǎo)并純化重組的S5、S9基因編碼蛋白,制備了抗S5、S9基因編碼蛋白的多克隆抗體。將11個抗體與純化的GCRV Ⅱ型病毒粒子進行Western blot檢測,結(jié)果顯示,抗S1、S3、S4、S6、S9、S10、S11編碼蛋白的抗體與病毒粒子反應(yīng)呈陽性,而抗S2、S5、S7、S8基因編碼蛋白的抗體與病毒粒子反應(yīng)呈陰性;將GCRV Ⅱ型病毒感染GSB細胞后分別用11個抗體進行IFA檢測,結(jié)果與Western blot的結(jié)果一致;采用中和試驗分析7個呈陽性反應(yīng)抗體的中和活性,將稀釋后的抗體分別與GCRV Ⅱ型病毒液等體積混合孵育后感染GSB細胞,RT-qPCR檢測感染后的病毒含量。結(jié)果顯示,與抗S6、S9、S10、S11基因編碼蛋白抗體作用的其病毒含量顯著降低,其中病毒含量最低的為抗S9基因編碼蛋白抗體。說明這4個抗體均有一定的中和活性,其中中和活性最強的為抗S9基因編碼蛋白抗體。3.S4、S9基因編碼蛋白免疫原性研究:將純化的S4、S9基因編碼蛋白單獨或與Seppic Gel佐劑乳化后腹腔注射免疫草魚。在一免和二免21 d后分別采集草魚血清、脾臟和頭腎組織,通過間接ELISA方法檢測草魚血清的特異性IgM抗體水平變化,通過相對定量PCR方法檢測脾臟和頭腎中IFN、TLR-3、TLR-7、Mx、IgM基因mRNA相對表達量的變化。結(jié)果顯示,S4、S9基因編碼蛋白加佐劑免疫組草魚血清OD_(450nm)值范圍為0.6~0.8,S4、S9基因編碼蛋白免疫組草魚血清OD_(450nm)值范圍為0.3~0.5,佐劑組和空白對照組OD_(450nm)值均小于0.2;S4、S9基因編碼蛋白加佐劑免疫組5個免疫因子基因mRNA的表達水平約是對照組的7~45倍,蛋白加佐劑免疫組血清中特異性抗體水平和組織中免疫因子的mRNA表達水平與對照組相比均顯著升高(P0.05),蛋白免疫組組織中免疫因子mRNA表達水平與對照組相比無明顯變化(P0.05);攻擊感染試驗結(jié)果表明,S4基因編碼蛋白加佐劑免疫組的相對保護率為37.9%,S9基因編碼蛋白加佐劑組的相對保護率為34.9%,均對草魚具有一定的免疫保護作用。綜上所述,GCRV Ⅱ型病毒的S1、S3、S4、S6、S9、S10、S11基因節(jié)段編碼的蛋白可能為病毒的結(jié)構(gòu)蛋白,S2、S5、S7、S8基因編碼的蛋白可能為病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白,其中S4和S6編碼的可能為病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白,S9編碼蛋白具有較強的中和活性;S4和S9編碼蛋白具有較好的免疫原性,對草魚感染GCRV Ⅱ型強毒株具有一定的免疫保護作用,為基因工程疫苗開發(fā)篩選候選抗原提供了依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S943

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