【摘要】：β-防御素(β-defensin,BD)是一種富含半胱氨酸具有廣譜抗菌活性的陽離子短肽。目前研究發(fā)現(xiàn),BD可以趨化免疫細胞遷移,在機體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本研究通過對團頭魴β-防御素1(MaBD1)進行表達和純化,獲得團頭魴β-防御素1重組蛋白,研究其對團頭魴白細胞,尤其是巨噬細胞的趨化作用和炎癥細胞因子表達的影響。實驗結(jié)果如下:1.構(gòu)建原核重組表達載體pET-32a-MaBD1,通過IPTG誘導(dǎo)表達MaBD1重組融合蛋白。將該蛋白利用Ni~(2+)親和層析方法純化后,再經(jīng)腸激酶酶切及純化,獲得MaBD1重組蛋白。使用MaBD1重組蛋白進行抑菌實驗,結(jié)果顯示MaBD1重組蛋白對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌活性。2.采用Percoll非連續(xù)梯度離心法分離團頭魴頭腎白細胞,再利用貼壁方法分離純化巨噬細胞,采用光鏡和透射電子顯微鏡進行鑒定,結(jié)果顯示:團頭魴頭腎白細胞主要包括:中性粒細胞、單核/巨噬細胞和淋巴細胞。貼壁巨噬細胞鋪展或伸長呈各種形狀,細胞核圓形和橢圓形,多數(shù)偏于細胞一側(cè)。巨噬細胞表面標(biāo)志CD68在貼壁巨噬細胞中高表達。3.用Transwell法檢測MaBD1的體外趨化活性,發(fā)現(xiàn)MaBD1重組蛋白對白細胞,尤其是巨噬細胞具有明顯趨化作用。為進一步了解MaBD1趨化功能位點,分別合成N端(MaBDP1)和C端(MaBDP2)MaBD1多肽,N端的趨化活性顯著高于C端。4.將MaBDP1注射團頭魴腹腔,觀察MaBDP1對體內(nèi)白細胞以及巨噬細胞趨化活性,結(jié)果顯示MaBDP1對體內(nèi)白細胞和巨噬細胞都有趨化作用。在2 d500 ng/mL MaBDP1對白細胞具有趨化作用。而在3 d 1000 ng/mL MaBDP1對巨噬細胞趨化作用明顯。qPCR檢測MaBDP1對促炎細胞因子(IL-1β和TNF-α)表達影響結(jié)果顯示:脾臟,頭腎和體腎中IL-1β表達量在6 h和72 h表達量顯著升高,肝胰腺中IL-1β表達量在6 h表達量顯著升高;脾臟,頭腎和體腎中TNF-α表達量在72 h顯著升高,肝胰腺中TNF-α表達量在6 h顯著升高。表明MaBDP1可以促進IL-1β和TNF-α的表達,增強機體的炎癥反應(yīng)。
【圖文】：

在先天免疫發(fā)揮重要作用。 防御素研究進展.1 防御素概述防御素（defensins）是物種進化中保留的有效天然免疫因子，它是一種分布于動植物界的富含半胱氨酸具有廣譜抗菌活性的陽離子短肽（Mak et996）。防御素包括 6-8 個保守的半胱氨酸，根據(jù)二硫鍵的連接方式可以將防可分為α-防御素、β-防御素和θ-防御素三類（圖 1-1）。防御素幾乎廣泛分布有的生物體中。人類首次從古比天蠶蛹中得到防御素（Hultmark et al 1980）類最早在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)防御素（Zou et al 2007）。在哺乳動物中，，首次在兔細胞中發(fā)現(xiàn)（Ganz et al 1985）。

圖 1-2：趨化過程示意圖1.2 魚類β-防御素研究進展目前在草魚、團頭魴、虹鱒、青溕、斑馬魚等魚類中均發(fā)現(xiàn)β-防御素（玉婷 2012, 張涓 2014, Zou et al 2007, Falco et al 2008, Zhao et al 2009）。這些防御素成熟肽一般由 39~45 個氨基酸殘基組成（郭洪燕 2012）。在魚類中，防御素在不同物種中表達有所差異，如斑馬魚β-防御素在皮膚、性腺、腸、脾、肝和腸中均有表達（Zou et al 2007），青溕的β-防御素主要表達在眼睛（Zhao et al 2009），而石斑魚的β-防御素只在垂體和精巢中表達，這可能和內(nèi)泌調(diào)節(jié)有關(guān)（Jin et al 2010）。β-防御素在不同組織中表達，說明β-防御素生物功能具有多樣性。另外，魚類β-防御素在分子特征、基因結(jié)構(gòu)上和哺乳類β御素也有很大的不同（郭洪燕 2012, Zou et al 2007, Zhao et al 2009），如魚類
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S943

【參考文獻】

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本文編號：2647989