【摘要】：β-防御素(β-defensin,BD)是一種富含半胱氨酸具有廣譜抗菌活性的陽離子短肽。目前研究發(fā)現(xiàn),BD可以趨化免疫細(xì)胞遷移,在機體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本研究通過對團頭魴β-防御素1(MaBD1)進(jìn)行表達(dá)和純化,獲得團頭魴β-防御素1重組蛋白,研究其對團頭魴白細(xì)胞,尤其是巨噬細(xì)胞的趨化作用和炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響。實驗結(jié)果如下:1.構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pET-32a-MaBD1,通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)MaBD1重組融合蛋白。將該蛋白利用Ni~(2+)親和層析方法純化后,再經(jīng)腸激酶酶切及純化,獲得MaBD1重組蛋白。使用MaBD1重組蛋白進(jìn)行抑菌實驗,結(jié)果顯示MaBD1重組蛋白對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌活性。2.采用Percoll非連續(xù)梯度離心法分離團頭魴頭腎白細(xì)胞,再利用貼壁方法分離純化巨噬細(xì)胞,采用光鏡和透射電子顯微鏡進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示:團頭魴頭腎白細(xì)胞主要包括:中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。貼壁巨噬細(xì)胞鋪展或伸長呈各種形狀,細(xì)胞核圓形和橢圓形,多數(shù)偏于細(xì)胞一側(cè)。巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志CD68在貼壁巨噬細(xì)胞中高表達(dá)。3.用Transwell法檢測MaBD1的體外趨化活性,發(fā)現(xiàn)MaBD1重組蛋白對白細(xì)胞,尤其是巨噬細(xì)胞具有明顯趨化作用。為進(jìn)一步了解MaBD1趨化功能位點,分別合成N端(MaBDP1)和C端(MaBDP2)MaBD1多肽,N端的趨化活性顯著高于C端。4.將MaBDP1注射團頭魴腹腔,觀察MaBDP1對體內(nèi)白細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞趨化活性,結(jié)果顯示MaBDP1對體內(nèi)白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都有趨化作用。在2 d500 ng/mL MaBDP1對白細(xì)胞具有趨化作用。而在3 d 1000 ng/mL MaBDP1對巨噬細(xì)胞趨化作用明顯。qPCR檢測MaBDP1對促炎細(xì)胞因子(IL-1β和TNF-α)表達(dá)影響結(jié)果顯示:脾臟,頭腎和體腎中IL-1β表達(dá)量在6 h和72 h表達(dá)量顯著升高,肝胰腺中IL-1β表達(dá)量在6 h表達(dá)量顯著升高;脾臟,頭腎和體腎中TNF-α表達(dá)量在72 h顯著升高,肝胰腺中TNF-α表達(dá)量在6 h顯著升高。表明MaBDP1可以促進(jìn)IL-1β和TNF-α的表達(dá),增強機體的炎癥反應(yīng)。
【圖文】：

在先天免疫發(fā)揮重要作用。 防御素研究進(jìn)展.1 防御素概述防御素（defensins）是物種進(jìn)化中保留的有效天然免疫因子，它是一種分布于動植物界的富含半胱氨酸具有廣譜抗菌活性的陽離子短肽（Mak et996）。防御素包括 6-8 個保守的半胱氨酸，根據(jù)二硫鍵的連接方式可以將防可分為α-防御素、β-防御素和θ-防御素三類（圖 1-1）。防御素幾乎廣泛分布有的生物體中。人類首次從古比天蠶蛹中得到防御素（Hultmark et al 1980）類最早在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)防御素（Zou et al 2007）。在哺乳動物中，，首次在兔細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)（Ganz et al 1985）。

圖 1-2：趨化過程示意圖1.2 魚類β-防御素研究進(jìn)展目前在草魚、團頭魴、虹鱒、青溕、斑馬魚等魚類中均發(fā)現(xiàn)β-防御素（玉婷 2012, 張涓 2014, Zou et al 2007, Falco et al 2008, Zhao et al 2009）。這些防御素成熟肽一般由 39~45 個氨基酸殘基組成（郭洪燕 2012）。在魚類中，防御素在不同物種中表達(dá)有所差異，如斑馬魚β-防御素在皮膚、性腺、腸、脾、肝和腸中均有表達(dá)（Zou et al 2007），青溕的β-防御素主要表達(dá)在眼睛（Zhao et al 2009），而石斑魚的β-防御素只在垂體和精巢中表達(dá)，這可能和內(nèi)泌調(diào)節(jié)有關(guān)（Jin et al 2010）。β-防御素在不同組織中表達(dá)，說明β-防御素生物功能具有多樣性。另外，魚類β-防御素在分子特征、基因結(jié)構(gòu)上和哺乳類β御素也有很大的不同（郭洪燕 2012, Zou et al 2007, Zhao et al 2009），如魚類
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S943

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 金鑫;張曼;范燕茹;王佩;楊銀鳳;;β-防御素在感染和炎癥過程中的作用[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2015年13期

2 胡媛;孫磊;徐馀信;曹建平;;東方田鼠肝內(nèi)巨噬細(xì)胞的分離和鑒定[J];中國血吸蟲病防治雜志;2015年03期

3 張萍萍;尹利榮;王芳;孫蓓;霍彥;;人源性防御素HD-5的原核表達(dá)及抗真菌作用的初步研究[J];天津醫(yī)藥;2014年08期

4 賈睿;杜金梁;曹麗萍;徐跑;王佳豪;劉英娟;殷國俊;蔣火金;柏愛旭;;豬血多肽對草魚離體培養(yǎng)免疫細(xì)胞活性的影響[J];南方農(nóng)業(yè)學(xué)報;2014年06期

5 郗明君;劉立春;張涓;湯孝成;劉小玲;林蠡;;3種殼聚糖對團頭魴體外頭腎吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能的影響[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2014年03期

6 樂海浪;羅國強;;創(chuàng)傷后早期炎癥因子TNF-a、IL-1、IL-6的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代診斷與治療;2014年04期

7 郭洪燕;楊桂文;安利國;;魚類β-防御素的研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2012年04期

8 吳旋;白東清;朱國霞;寧博;;長期投喂黃芪多糖對黃顙魚免疫細(xì)胞活性的影響[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2011年05期

9 趙樸;鄭玉姝;王憲文;劉興友;劉麗艷;;防御素在抗病毒免疫中的作用[J];生物技術(shù);2008年04期

10 周啟勝;孫明生;;CD68在膽囊壁中的表達(dá)及意義[J];肝膽外科雜志;2008年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 趙鵬偉;蒙古綿羊β-防御素-1的表達(dá)、純化及生物學(xué)功能研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

2 劉小玲;應(yīng)激對黃顙魚非特異性免疫細(xì)胞的影響[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 史玉婷;草魚腸道β-防御素克隆表達(dá)及抗菌活性分析[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

2 袁娜娜;Real-time PCR精確定量檢測CD68陽性巨噬細(xì)胞在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義[D];鄭州大學(xué);2012年

3 鐘志霞;重組人β-防御素的表達(dá)和純化研究[D];浙江大學(xué);2006年

4 馮碧;三種環(huán)境激素對魚類免疫細(xì)胞活性與功能的影響[D];浙江大學(xué);2003年

本文編號：2647989