【摘要】：傳染性胰臟壞死(Infectious pancreatic necrosis,IPN)是由屬于雙RNA病毒科(Birnaviridae)水生雙RNA病毒屬(Aquabirnavirus)的傳染性胰臟壞死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)引起的一種嚴(yán)重的魚類急性傳染病。該病主要危害鮭鱒幼魚,也可造成成年鮭鱒和許多其他魚類嚴(yán)重的急性感染,流行范圍遍及亞洲、歐洲、美洲多個國家。1986年在我國山西省虹鱒魚場首次暴發(fā)IPN,隨后我國多地區(qū)接連報道IPN疫情,2013年在我國云南省分離到血清型為A9的IPNV毒株ChRtm213(登錄號KX234591),是不同于以往血清型的我國現(xiàn)行IPNV毒株。本研究針對我國現(xiàn)行IPNV毒株開展了以活酵母為載體的口服疫苗研究,以期為IPNV免疫防控奠定基礎(chǔ)。VP2蛋白是IPNV的主要抗原蛋白,是作為病毒檢測及疫苗構(gòu)建的主要蛋白基因。為了將VP2蛋白展示于酵母細(xì)胞表面,本研究基于IPNV VP2蛋白基因序列設(shè)計了引物,以IPNV ChRtm213的RNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到酵母表面展示載體pYD1上構(gòu)建了重組質(zhì)粒pYD1-VP2,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母EBY100感受態(tài)細(xì)胞,得到含有重組質(zhì)粒的酵母菌EBY100-pYD1-VP2。向EBY100-pYD1-VP2加入半乳糖進(jìn)行VP2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),采用蛋白免疫印跡和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)對VP2蛋白的酵母表面展示情況進(jìn)行了分析。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)后VP2蛋白在酵母細(xì)胞表面獲得了成功表達(dá);細(xì)胞免疫熒光分析結(jié)果顯示重組酵母誘導(dǎo)表達(dá)后出現(xiàn)特異性綠色熒光,并且在一定時間內(nèi),熒光強(qiáng)度與誘導(dǎo)時間成正相關(guān),免疫實驗組與對照組相比熒光酵母比例差異顯著(P0.05)。上述研究結(jié)果表明VP2蛋白已經(jīng)被酵母細(xì)胞高效表達(dá)并且成功展示于酵母細(xì)胞表面。為了評價該口服疫苗的免疫效果,對虹鱒魚(5±1克平均體重)進(jìn)行了口服免疫試驗。虹鱒魚(5±1克平均體重)分為3組,每組包含150尾虹鱒魚(設(shè)兩個平行),將表達(dá)了VP2蛋白的新鮮酵母細(xì)胞EBY100-pYD1-VP2(1×10~(10)CPU/ml)懸浮于100 uL PBS中,通過口服強(qiáng)飼法對各組虹鱒魚接種100 uL/尾。另外設(shè)空載體組飼喂酵母細(xì)胞EBY100-pYD1(1×10~(10) CPU/ml)和PBS組飼喂PBS溶液。在免疫后第30天,對疫苗組、空載體組和PBS組虹鱒進(jìn)行腹腔注射攻毒,攻毒劑量為100 uL 100TCID50/ml IPNV病毒懸液,攻毒后第30天采用實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)測定疫苗組、空載體組和PBS組虹鱒VP1和VP4基因的表達(dá)水平以確定虹鱒體內(nèi)病毒載量,以不攻毒的虹鱒為陰性對照。病毒載量實驗結(jié)果顯示在攻毒后第30天,空載體組和PBS組虹鱒VP1基因的載量分別為疫苗組的147倍和181倍。VP4基因的表達(dá)量為分別為170倍和189倍。該結(jié)果表明,用EBY100-pYD1-VP2接種可使虹鱒的平均病毒載量顯著降低(P0.05)。在免疫后第60天,采用中和抗體實驗(Neutralizing antibodies test)測定疫苗組和空載體組虹鱒血清IPNV中和抗體效價。中和抗體實驗結(jié)果顯示,在免疫后第60天,疫苗組虹鱒血清IPNV平均中和抗體效價為30.2,顯著高于空載體組(P0.05)。在免疫后第7天和14天,利用RT-qPCR定量分析疫苗組、空載體組和PBS組虹鱒頭腎、脾臟和后腸組織中IgM、IgT、CD4和CD8基因的表達(dá)水平。實驗結(jié)果顯示,在免疫后第7天,疫苗組虹鱒頭腎中IgM和IgT的表達(dá)量分別為PBS組的6.9倍和5倍,脾臟中為7.9倍和5.6倍,后腸中為8.6倍和5.8倍,與PBS組相比,疫苗組虹鱒頭腎、脾臟和后腸中IgM和IgT基因的表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05)。在免疫后第7天,疫苗組虹鱒頭腎中CD4和CD8的表達(dá)量分別為PBS組的5.3倍和8.2倍,脾臟中為7.1倍和8.7倍,后腸中為PBS組的8.6倍和7.2倍,疫苗組虹鱒頭腎、脾臟和后腸中CD4和CD8基因的表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05)。在免疫后第14天,疫苗組虹鱒脾臟和后腸中CD4表達(dá)水平分別為PBS組的11倍和8.2倍,CD4基因表達(dá)顯著上調(diào)(P0.05)。綜合病毒載量、中和抗體效價分析和免疫相關(guān)基因表達(dá)量分析結(jié)果,口服接種EBY100-pYD1-VP2使虹鱒體內(nèi)IPNV載量顯著下降,并且產(chǎn)生較高水平的中和抗體效價,誘導(dǎo)了免疫相關(guān)基因IgM、IgT、CD4和CD8表達(dá)的顯著增加。本研究表明利用酵母表面展示系統(tǒng)構(gòu)建的IPNV口服疫苗能夠顯著降低虹鱒體內(nèi)IPNV病毒載量,刺激虹鱒非特異性免疫和特異性免疫反應(yīng),為今后制備抗IPNV的新型口服活載體疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

感染 IPNV后的病魚常具有食欲減退、體色發(fā)黑、眼球突出、腹部腫脹、肛門紅腫等癥狀，，解剖后可見胰腺壞死、腎臟腫大、腸內(nèi)有粘液狀滲出物、腹水等癥狀[13]。晚期病魚的肝臟和鰓上皮組織嚴(yán)重出血，肝臟和胰臟細(xì)胞核固縮，出現(xiàn)空泡變性，胰腺中有炎癥細(xì)胞浸潤的脂肪組織發(fā)生彌散性壞死[13]。感染 IPNV 幸存的魚可不再發(fā)病，但是終生攜毒，依然能傳染病毒。IPNV可通過攜帶病毒的水體、網(wǎng)具、容器、染病魚的排泄物和精液進(jìn)行水平傳播[13]。1.3 基因型分型用 MegAlign 軟件分析基因型，以 VP2 基因片段為目標(biāo)基因，同 GenBank 收錄的其他國家 IPNV分離株及部分水生雙 RNA病毒進(jìn)行 VP2 核苷酸序列同源性分析。Blake[36]等證明，IPNV病毒基于 VP2 氨基酸序列可分為 6 個基因組 genogroups（1-6）。一些研究者認(rèn)為，海洋雙 RNA 病毒應(yīng)該形成一個新的基因組genogroup7[37-38]，Ji 等對一株分離于虹鱒的中國 IPNV毒株 ChRtm213 采用鄰位相鄰法構(gòu)建了 IPNV的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖 1-1）[39]。該進(jìn)化樹清晰地將目前水生雙 RNA病毒分為 7 個基因組。

膜免疫主要通過口服抗原引發(fā)。劉-VP3 重組蛋白并進(jìn)行口服免疫，結(jié)，對 IPNV的入侵起到保護(hù)作用�？梢詫⑼庠吹鞍渍故驹诮湍副砻娴脑诮湍副磉_(dá)載體的 Aga2 基因下游蛋白融合蛋白會在信號肽的作用下 Aga2 蛋白亞基識別酵母表面的 A之融合的目的蛋白間接的錨定在酵，酵母細(xì)胞還可以對蛋白進(jìn)行修飾[18]。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S948

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2632764