【摘要】：海洋兩棲性無脊椎動物瘤背石磺在中國沿海較易獲取,且中樞神經(jīng)系統(tǒng)易分離,是一種優(yōu)良的動物模型。高等脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)較軟體動物的神經(jīng)系統(tǒng)更為復(fù)雜精細(xì),在神經(jīng)研究上也較簡單無脊椎動物更困難,故研究者常用軟體動物加州海兔作為神經(jīng)基礎(chǔ)研究材料,但加州海兔在中國本土基本不能獲取,需選擇一種合適的軟體動物替代。海洋兩棲性無脊椎動物瘤背石磺在中國沿海較易獲取,且中樞神經(jīng)系統(tǒng)易分離,是一種優(yōu)良的動物模型,且其生活在環(huán)境多變的潮間帶,具有多種生物節(jié)律,是研究生物節(jié)律和長期記憶相關(guān)性的良好材料。在本實(shí)驗(yàn)室前期研究基礎(chǔ)上,以四種石磺為實(shí)驗(yàn)材料,通過形態(tài)分析和分子實(shí)驗(yàn)分析選擇瘤背石磺為最適宜的實(shí)驗(yàn)對象,選取瘤背石磺神經(jīng)節(jié)為研究材料,對石磺的學(xué)習(xí)記憶能力和生物節(jié)律性進(jìn)行初步探討,旨在開發(fā)一種中國的地方性神經(jīng)模式種為研究學(xué)習(xí)記憶能力提供便利,也為研究潮間帶生物節(jié)律提供了一個(gè)良好的模型。本文主要通過行為學(xué)測定、石磺神經(jīng)各時(shí)期的目的基因表達(dá)、目的基因的原位雜交技術(shù)對石磺學(xué)習(xí)記憶能力和生物節(jié)律性進(jìn)行初步探索。1.蛋白質(zhì)的合成對瘤背石磺長期記憶的影響瘤背石磺背部在受到外界電刺激時(shí),其外套膜邊緣上翹,同時(shí)外套膜上的顆粒腺分泌深棕色液體,并伴有刺激性氣味。將這一系列的防御行為命名為“外套膜上翹反應(yīng)(Mantle-upturned Reflex,MUR)”,并以這一行為的反應(yīng)程度作為衡量記憶程度的指標(biāo)。瘤背石磺通過一系列電刺激訓(xùn)練,表現(xiàn)出逐步強(qiáng)烈的外套膜上翹反應(yīng),從而獲得穩(wěn)定的長期記憶。在不同訓(xùn)練時(shí)間段抑制石磺神經(jīng)的蛋白質(zhì)合成,發(fā)現(xiàn)在長期記憶形成階段,抑制蛋白質(zhì)合成只影響瘤背石磺一段時(shí)間內(nèi)的記憶形成,但不影響24小時(shí)后通過正常訓(xùn)練再次形成的長期記憶;同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)合成在記憶再鞏固階段的重要性。2.瘤背石磺OnCREB1和OnCREB2基因的克隆及定位定量分析本實(shí)驗(yàn)從神經(jīng)節(jié)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定得到與長期記憶形成相關(guān)的兩個(gè)環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白亞型基因的部分序列,通過RT-PCR和RACE法獲得這兩個(gè)基因的全長,命名為OnCREB1和OnCREB2。OnCREB1基因全長2426 bp,包括3’非翻譯區(qū)(3’UTR)255 bp,5’非編碼區(qū)(5’UTR)1360 bp,開放閱讀框813 bp,共編碼270個(gè)氨基酸。該蛋白包括C端的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(BZIP)和N端的激酶誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(KID):BZIP主要結(jié)合DNA,預(yù)測該蛋白第164位的賴氨酸為結(jié)合位點(diǎn);軟件預(yù)測KID功能區(qū)的Ser-85和Ser-94可被磷酸化,從而激活由OnCREB1基因編碼的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄活性。OnCREB2基因全長3859 bp,包括3’非翻譯區(qū)(3’UTR)593 bp,5’非編碼區(qū)(5’UTR)2108 bp,開放閱讀框1158 bp,共編碼385個(gè)氨基酸。OnCREB2蛋白二聚體形式主要是在亞基間氫鍵作用力和5對亮氨酸殘基疏水作用下形成,該蛋白只含有C端的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域,并不存在可被磷酸化的位點(diǎn),故預(yù)測OnCREB2編碼的蛋白只能結(jié)合下游DNA,但推測其并不具有轉(zhuǎn)錄活性。qRT-PCR檢測石磺神經(jīng)節(jié)在“對照組”以及“訓(xùn)練組”的OnCREB1和OnCREB2基因的表達(dá)量,結(jié)果顯示OnCREB1在已經(jīng)形成長期記憶的“訓(xùn)練組”表達(dá)量遠(yuǎn)高于不能對刺激形成長期記憶的實(shí)驗(yàn)組,OnCREB2在訓(xùn)練后表達(dá)量雖有上升但不明顯,表明OnCREB1編碼的蛋白在長期記憶形成的過程中發(fā)揮重要的作用。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)通過原位雜交技術(shù)檢測OnCREB1和OnCREB2基因在瘤背石磺神經(jīng)節(jié)中動態(tài)分布情況。瘤背石磺在未進(jìn)行訓(xùn)練前,OnCREB1主要分布在足神經(jīng)節(jié)和側(cè)神經(jīng)節(jié);經(jīng)過訓(xùn)練后,OnCREB1不僅在足神經(jīng)節(jié)和側(cè)神經(jīng)節(jié)中表達(dá),而且OnCREB1信號還出現(xiàn)在腦神經(jīng)節(jié)中,在臟神經(jīng)節(jié)中的信號也有所加強(qiáng)。同樣,OnCREB2信號起初只出現(xiàn)在未訓(xùn)練石磺神經(jīng)中側(cè)神經(jīng)節(jié)和足神經(jīng)節(jié)區(qū)域里,而經(jīng)過訓(xùn)練后石磺的所有神經(jīng)節(jié)均出現(xiàn)OnCREB2信號。OnCREB基因動態(tài)分布過程說明記憶形成是神經(jīng)節(jié)之間相互的聯(lián)系,而不局限單個(gè)神經(jīng)節(jié)或者單個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞。3.瘤背石磺學(xué)習(xí)記憶能力與生物節(jié)律性的相關(guān)性測定不同時(shí)間段下瘤背石磺在光照-黑暗(LD)和持續(xù)黑暗(DD)的環(huán)境中學(xué)習(xí)和記憶的行為學(xué)差異,結(jié)果表明瘤背石磺屬于夜行性動物,在夜間受到刺激并作出防御反應(yīng)的覺醒閾值更低。另有研究表明,LD周期可以掩蔽潮間帶動物行為上的潮汐節(jié)律性,從而只表現(xiàn)晝夜節(jié)律性。瘤背石磺在一天中的不同時(shí)間段學(xué)習(xí)能力不同,導(dǎo)致學(xué)習(xí)獲取量不同,在LD和DD環(huán)境中的學(xué)習(xí)獲取量也有區(qū)別,由此表明學(xué)習(xí)獲取量是受晝夜節(jié)律和LD掩蔽效應(yīng)調(diào)控。而不同時(shí)間段的長期記憶形成的趨勢圖和學(xué)習(xí)獲取量的趨勢圖近乎相似,故推測長期記憶的形成程度是由石磺最初的學(xué)習(xí)所獲得記憶量所決定的。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)測定了與長期記憶形成有關(guān)的OnCREB1基因和與晝夜節(jié)律相關(guān)的per2基因及與月節(jié)律和潮汐節(jié)律相關(guān)的cry基因在瘤背石磺一天各時(shí)間段中的表達(dá)量趨勢。Per2在LD和DD中的24點(diǎn)(ZT18和CT18)的表達(dá)量都到達(dá)一個(gè)峰值。在LD條件下,潮汐節(jié)律受到LD周期的掩蔽,cry的表達(dá)模式?jīng)]有規(guī)律性,OnCREB1基因的表達(dá)模式圖和per 2基因基本一致;在DD條件下,OnCREB1表達(dá)模式圖存在兩個(gè)峰,分別與per2和cry的峰一致。由此,在分子水平上可以得出長期記憶的形成具有生物節(jié)律性,且其在形成的過程中極易受到LD周期掩蔽的影響。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S917.4
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