【摘要】：大黃魚(Larimichthys crocea)源殺香魚假單胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是引起大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病的主要致病菌,該病每年在我國沿海網(wǎng)箱養(yǎng)殖的大黃魚上均有不同程度的爆發(fā),發(fā)病后致死率高、危害嚴(yán)重,目前尚無有效防治措施,給大黃魚養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。本研究根據(jù)NCBI收錄的殺香魚假單胞菌NB2011株全基因組序列(GenBank Accession:NZ_ASJX00000000),基于反向疫苗的開發(fā)思路,通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫從基因組中預(yù)測、篩選菌體的外膜蛋白作為候選免疫原,將其克隆后在大腸桿菌中重組表達(dá),并對獲得的重組蛋白進(jìn)行免疫原性分析,研究結(jié)果如下:一、本研究從NB2011株基因組中共預(yù)測、篩選出28個外膜蛋白基因作為候選免疫原,其中10個為外膜結(jié)構(gòu)蛋白,10個為毒力分泌相關(guān)蛋白,3個脂蛋白,2個孔蛋白,其他外膜蛋白3個。二、通過設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增引物,成功克隆出28個外膜蛋白的基因,經(jīng)測序比對,其中27個基因的序列與NB2011株100%吻合,其中1個編號P10(EPB95217)的基因與NB2011株存在1個堿基的差異,多次重復(fù)試驗(yàn)均證實(shí)差異的存在,分析表明,該處堿基差異不會終止翻譯,應(yīng)為有效的編碼序列。三、本研究成功構(gòu)建了28個外膜蛋白的原核表達(dá)載體(pET-30(a)-n),通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件,共有18個重組蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá),經(jīng)包涵體檢測,其中2個蛋白為可溶性表達(dá),其余16個為包涵體形式。四、制備了效價為1∶6400的新西蘭兔抗殺香魚假單胞菌多克隆抗體,應(yīng)用抗體對重組表達(dá)的18個外膜蛋白進(jìn)行了免疫原性的Western Blot分析,結(jié)果表明,與有10個重組蛋白與多抗結(jié)合較強(qiáng),有8重組蛋白與多抗結(jié)合稍弱。五、從兔抗檢測具有較強(qiáng)免疫原性的重組外膜蛋白中,選取了P15、P16、A6、B6四個外膜蛋白進(jìn)行了魚體免疫攻毒試驗(yàn),結(jié)果表明,大黃魚攻毒后第6天開始出現(xiàn)死亡,檢剖內(nèi)臟有明顯白點(diǎn),至第14天時,統(tǒng)計(jì)得到免疫組中P15、P16的相對保護(hù)率分別為15.79%和5.26%,A6和B6的相對保護(hù)率分別為68.42%和52.63%。綜上,本研究運(yùn)用反向疫苗原理開展了大黃魚源殺香魚假單胞菌外膜蛋白亞單位疫苗抗原的預(yù)測、制備和初步篩選等工作,研究結(jié)果為大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病的疫苗防治提供了有益的借鑒。
【圖文】：

胞菌基因組 DNA 濃度及條帶分所用的材料菌株 ZS1306003，是由大黃魚內(nèi)臟。菌株經(jīng)平板劃線復(fù)蘇養(yǎng)，，使用試劑盒抽提全基因組 D凝膠電泳結(jié)果如圖 1 所示，條帶度高，說明基因組提取完整，降解程。

圖 2.候選外膜蛋白基因 PCR 產(chǎn)物膠照片F(xiàn)ig 2. Photo of candidate outer membrane protein gene PCR product gel編號引物Tm 值(F/R)退火溫度(℃)片段長度72℃延伸時間編號引物Tm 值(F/R)退火溫度(℃)片段長度72℃延伸時間A1 61/71 61 1149bp 65s P28 62/62 62 1191bp 75sA2 60/64 61 1269bp 70s P29 61/63 62 636bp 45sA3 69/81 69 1239bp 75s P30 66/64 65 675bp 45sA5 61/79 62 1239bp 75s P3 55/63 54 840bp 50sA6 58/59 59 1335bp 80s P7 51/72 51 774bp 45sB1 79/61 61 762bp 50s P9 68/72 65 1338bp 80sB4 59/63 59 768bp 50s P10 67/64 64 1020bp 60sB6 61/64 61 594bp 40s P11 64/69 64 501bp 30sB10 73/75 73 717bp 45s P12 52/53 53 693bp 45s
【學(xué)位授予單位】：浙江海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S943

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳夏冰;陳潔;付書林;何斌;邵志勇;姚艷豐;楊文海;劉武;金爾光;童偉文;陶弼菲;;胸膜肺炎放線桿菌外膜蛋白W自殺性質(zhì)粒的構(gòu)建[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2017年01期

2 張斌;湯承;岳華;;副豬嗜血桿菌主要外膜蛋白基因研究進(jìn)展[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2013年01期

3 駱延波;劉霞;黃迪海;張從敬;劉曉飛;張華;徐秀榮;張?jiān)佥x;;豬胸膜肺炎放線桿菌外膜蛋白型的研究[J];山東農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年03期

4 祝小平;;歐洲西北部流腦流行與B群血清型的關(guān)系[J];預(yù)防醫(yī)學(xué)情報;1987年06期

5 賈航;王晟欣;章小利;郭楊;徐晶;;壞死梭桿菌93ku重組外膜蛋白的免疫原性分析[J];系統(tǒng)醫(yī)學(xué);2020年01期

6 高明燕;徐步;龔建森;范建華;呂曉娟;劉學(xué)賢;胡茂志;;禽多殺性巴氏桿菌血清型與外膜蛋白型相關(guān)性研究[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2011年15期

7 柏建山;蔡先全;鄧艷;黃燕瓊;;阪崎腸桿菌外膜蛋白基因的克隆與序列分析[J];中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2011年10期

8 余全,俞樹榮,胡廷徽;Q熱立克次體17kD外膜蛋白基因的克隆與表達(dá)[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1997年01期

9 林海英,王航,盛軍,孟春,郭養(yǎng)浩;肺炎球菌外膜蛋白A的分離純化及免疫原性[J];藥物生物技術(shù);2005年02期

10 曹素芳,黃青云,韓先干,鄧憲方;禽多殺性巴氏桿菌C_(48-1)外膜蛋白H基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J];中國獸醫(yī)科技;2005年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 姚邵云;簡紀(jì)常;吳灶和;;溶藻弧菌主要外膜蛋白的純化及其免疫保護(hù)性研究[A];中國水產(chǎn)學(xué)會第五屆青年學(xué)術(shù)年會摘要集[C];2004年

2 李曉霞;柴同杰;;腸致病性大腸桿菌外膜蛋白免疫保護(hù)性研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2006學(xué)術(shù)年會論文集（下冊）[C];2006年

3 朱珊麗;鄭丹;歐琴;陳俊;陳韶;張麗芳;;沙眼衣原體主要外膜蛋白T、B細(xì)胞多表位基因的表達(dá)及其鑒定[A];中國免疫學(xué)會第五屆全國代表大會暨學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2006年

4 趙金平;段麗華;郭松林;;鰻鱺病原菌外膜蛋白三聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)與產(chǎn)物的純化[A];2014年中國水產(chǎn)學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2014年

5 高明燕;徐步;龔建森;范建華;呂曉娟;劉學(xué)賢;胡茂志;;禽多殺性巴氏桿菌血清型與外膜蛋白型相關(guān)性研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

6 郭曉雅;史皆然;邵成;師長宏;趙勇;吳昌歸;;沙門菌外膜蛋白D的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備[A];中華醫(yī)學(xué)會第七屆全國哮喘學(xué)術(shù)會議暨中國哮喘聯(lián)盟第三次大會論文匯編[C];2010年

7 謝昌平;易龍;盧占軍;蘇華楠;黃愛軍;;柑橘黃龍病菌外膜蛋白的研究進(jìn)展[A];中國植物病理學(xué)會2015年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2015年

8 邱薇;孟佩云;尹惠瓊;范泉水;李剛山;劉燕;王維祥;王雙印;;三株鉤端螺旋體外膜蛋白基因的比較[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會養(yǎng)犬學(xué)分會第十二次全國養(yǎng)犬學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2007年

9 何誠;朱虹;王傳武;何君;張浩杰;檀華;端青;;鸚鵡熱衣原體重組主要外膜蛋白免疫肉雞效果觀察[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)病理學(xué)分第12次暨中國動物病理生理學(xué)專業(yè)委員會第11次學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2003年

10 丁伯良;鄢明華;王英珍;李秀麗;黃金海;白朋勛;王東;張健;趙向華;;雞大腸桿菌異型外膜蛋白原生質(zhì)體融合菌株的構(gòu)建[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會成立20周年慶典暨第十次學(xué)術(shù)研討會論文集（下）[C];2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張黎;外膜蛋白功能性結(jié)構(gòu)研究[D];吉林大學(xué);2017年

2 毛芝娟;副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus主要外膜蛋白的克隆、表達(dá)和免疫原性研究[D];浙江大學(xué);2007年

3 張蕾;幾種布魯菌抗原的免疫學(xué)特性研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2011年

4 孟艷芬;黑龍江立克次體與血管內(nèi)皮細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞相互作用的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

5 周祖濤;鴨疫里氏桿菌免疫診斷方法及在感染鴨肝臟差異表達(dá)基因的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

6 李研東;食品中弧菌免疫學(xué)篩檢方法建立研究[D];吉林大學(xué);2009年

7 張明亮;銅綠假單胞菌F_(190-342)-I_(21-83)基因重組鼠傷寒沙門菌的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)免疫研究[D];吉林大學(xué);2015年

8 曹葉;鼠疫耶爾森菌外膜蛋白J參與宿主免疫逃逸機(jī)制的研究[D];吉林大學(xué);2017年

9 侯博;TolC在腸外致病性大腸桿菌中的生物學(xué)功能研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

10 鄒凌云;外膜蛋白序列和結(jié)構(gòu)辨識相關(guān)問題研究[D];國防科學(xué)技術(shù)大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 汪浩;大黃魚源殺香魚假單胞菌外膜蛋白的預(yù)測、克隆表達(dá)及免疫原性初步分析[D];浙江海洋大學(xué);2019年

2 王艷;禽致病性大腸桿菌OmpT質(zhì)粒編碼外膜蛋白的表達(dá)、純化與結(jié)構(gòu)的初步研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2019年

3 李燕;嗜麥芽窄食單胞菌外膜蛋白A的生物信息學(xué)分析及其粘膜免疫保護(hù)性的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

4 趙赫;苦參堿對外膜蛋白A過表達(dá)大腸桿菌體外生物被膜形成影響的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2018年

5 劉敏;柑橘黃龍病菌亞洲種（Candidatus Liberibacter asiaticus）外膜蛋白基因亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

6 趙金平;鰻鱺病原菌外膜蛋白基因工程三聯(lián)表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性研究[D];集美大學(xué);2015年

7 童志霞;布魯氏菌主要外膜蛋白對樹突狀細(xì)胞成熟度及抗原遞呈的影響[D];石河子大學(xué);2018年

8 李本強(qiáng);重組外膜蛋白抗原檢測豬胸膜肺炎放線桿菌ELISA方法的建立[D];天津農(nóng)學(xué)院;2010年

9 魏常梅;鮑曼不動桿菌外膜蛋白W在臨床分離株中的表達(dá)及其致病性研究[D];內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué);2016年

10 張桂華;豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及六個外膜蛋白的免疫原性研究[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

本文編號：2632753