【摘要】：魚類的抗凍蛋白是由生活于極地海洋的魚類產(chǎn)生,是能降低血液和體液冰點(diǎn)的一類蛋白。魚類抗凍蛋白通過一個(gè)特殊的表面吸附于冰晶表面,抑制冰晶的生長(zhǎng)。長(zhǎng)期以來,人們認(rèn)為抗凍蛋白只是一種與冰晶結(jié)合的蛋白,不具有其他的生物學(xué)功能。然而,近來通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物的研究,證明一些抗凍蛋白在沒有冰晶存在的低溫狀態(tài)下具有增強(qiáng)細(xì)胞和個(gè)體抵抗低溫脅迫的分子生物學(xué)功能,并有望用于抗寒育種。本實(shí)驗(yàn)室在過去的研究中從南極魚eelpout鑒定了一種具有四個(gè)結(jié)構(gòu)域更高抵抗低溫脅迫能力的Ⅲ型抗凍蛋白基因LD4。本項(xiàng)研究我們?cè)噲D闡述LD4抵抗寒冷的保護(hù)機(jī)制。首先,本研究從南極魚Lycodichthys dearborni的多聚三型抗凍蛋白基因LD12cDNA中克隆得到AFPⅢ的四聚體,命名為L(zhǎng)D4,并構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒Tol2-actin-LD4-2A-EGFP。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到斑馬魚細(xì)胞系ZF4中。LD4可以在ZF4中大量表達(dá)并且能夠減少斑馬魚細(xì)胞在低溫脅迫下的死亡率。通過對(duì)相同培養(yǎng)條件的轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析基因表達(dá)譜的變化。我們找到26個(gè)表達(dá)差異轉(zhuǎn)錄因子,其中I3MB13、ZNF687b等在LD4轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),JUN、Cremb等在LD4轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。這些表達(dá)差異顯著的轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)進(jìn)行熒光定量PCR的驗(yàn)證。我們對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行KEGG pathway分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),這些差異性基因主要參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、增殖等調(diào)節(jié)信號(hào)通路。然后采用Annexin V-PE/7-AAD雙染色法對(duì)3種不同溫度下的WT,EGFP和LD4細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè),結(jié)果顯示LD4在低溫下與對(duì)照組(EGFP和WT)相比凋亡率沒有顯著差異,說明LD4可能是通過其他通路而不是單純通過抑制細(xì)胞凋亡來抵御低溫脅迫。這個(gè)研究提供了新的視角發(fā)現(xiàn)LD4抵御低溫的分子機(jī)制。
【圖文】：

5圖 1.1 a 南極環(huán)流圖 b 南極海水溫度變化示意圖lation at the South Pole figure b Ocean temperature of期大約5億9千萬年前，南極洲、非洲、新西蘭大陸岡瓦那的一部分，南極洲的環(huán)境還屬于溫約6于5百萬年前，南極洲緩慢移動(dòng)到達(dá)現(xiàn)在的漸變冷，直到4千萬年前的始新世后期，南極極大陸附近海域逐漸形成大量的海冰[23]。大的形成便南極洲與其他地區(qū)完全隔離，從而形rcumpolar Current，ACC)和位于大約南緯500至r Front，APF)。在南極圈附近，表層向北移動(dòng)的輕的亞南極海域的海水底部，從而產(chǎn)生持續(xù)的度比南極圈內(nèi)的海水溫度升高3℃，這是形成(The Southern Ocean)是圍繞著南極大陸的大片

7圖 1.3 抗凍蛋白吸附抑制冰晶表面的示意圖A、0℃溶液里的抗凍蛋白與冰晶接觸冰水在過冷環(huán)境里處于不平衡凝固點(diǎn)，彎曲的位置結(jié)合抗凍蛋白，，從而阻止冰晶生長(zhǎng)線的地方表示多結(jié)合的AFPC、結(jié)合更多的抗凍蛋白，虛線表示冰水界面結(jié)合新的抗凍蛋白Fig1.3 The sketch of Antifreeze protein adsorption inhibit ice crystals on the surface
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4

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