【摘要】：I型干擾素是先天性免疫應(yīng)答的一類重要的細胞因子,在抗病毒和抗癌中都有廣泛地效用。鯽魚與草魚的I型干擾素有很高的同源性。在我們先前的實驗中,重組草魚干擾素的免疫保護作用以及抗病毒功能已經(jīng)在草魚細胞和組織中得到了驗證。為了探究重組草魚干擾素對鯽魚的免疫保護作用以及它的作用機制,我們用poly I:C建立了一個病毒感染鯽魚模型,然后用重組草魚干擾素進行免疫保護實驗。在本實驗中,我們構(gòu)建了pBV220-CiIFN重組質(zhì)粒并且用大腸桿菌BL21(DE3)pLys S作為表達重組草魚干擾素的宿主菌。采用原核表達的方法42℃誘導4 h獲得大量的rCiIFN蛋白,進一步通過切膠回收的方法得到純化的蛋白。最后經(jīng)過SDS-PAGE檢測純化后的r CiIFN大小約為21kDa,蛋白濃度測定試劑盒測出濃度為330μg/ml。將蛋白稀釋到合適濃度,為了評估在poly I:C下r CiIFN對鯽魚體內(nèi)的保護效果,我們采用口服的方法免疫鯽魚。在給鯽魚腹腔注射poly I:C之前,分別連續(xù)投喂1d、2d和3d拌有rCiIFN蛋白的飼料,并確保每克魚體重能攝入1μg的重組蛋白。結(jié)果表明,與對照組的鯽魚相比,口服免疫的方法確實能對鯽魚起到更好的保護效果,其中連續(xù)投喂3d的鯽魚相對存活率是54.29%,要高于連續(xù)投喂2d和1d的存活率,連續(xù)投喂2d和1d的鯽魚存活率分別是47.83%和38.81%。然而對照組的存活率與實驗組的相比則低得多,投喂了1d、2d和3d的存活率分別為16.25%、13.75%和12.50%。為進一步了解重組草魚干擾素對鯽魚免疫保護的分子機理,我們通過實時熒光定量PCR的方法分析rCiIFN對PKR以及IFN的誘導表達效果。在鯽魚腹腔注射rCiIFN蛋白的24h、48h、72h以及對照組腹腔注射PBS后分別提取鯽魚肝、腸、心、腎、鰓五個組織的總RNA,之后反轉(zhuǎn)得到其cDNA。采用實時熒光定量PCR的方法檢測鯽魚五個組織中IFN以及PKR的表達情況。通過與對照組相應(yīng)組織中IFN以及PKR的表達量相比,實驗組腹腔注射了r CiIFN的所有的組織中的IFN以及PKR的表達量都有上調(diào)趨勢,IFN以及PKR大都在48 h或72 h之后的表達量達到最高。這些結(jié)果表明當鯽魚在poly I:C刺激下重組干擾素具有抗病毒活性并且采用rCiIFN拌料投喂的方式免疫鯽魚能使其有保護作用。
【圖文】：

重組質(zhì)粒的構(gòu)建FN)基因的特異擴增室 先 前 構(gòu) 建 好 的 重 組 草 魚 干 擾 iIFN，重新構(gòu)建 pBV220-CiIFN 重組質(zhì)粒SD sequence (用于結(jié)合原核生物核糖體的入帶起始 ATG 的外源基因，可表達非融止出現(xiàn)“通讀”現(xiàn)象，有利于質(zhì)粒-宿主系利于增加其拷貝數(shù)及容量。因其含有 PL用而又對溫度敏感的 cl 蛋白基因 clts857 中的外源基因的轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控。pBV220 載體，，能夠在 42 ℃表達非融合的目的蛋

第三章 結(jié)果和分析第三章 結(jié)果與分析 重組質(zhì)粒的構(gòu)建)基因的特異性擴增及其純化的重組草魚干擾素表達菌株 B魚干擾素基因片段，利用草魚擴增。通過 1 %瓊脂糖凝膠電泳大小符合預期片段大小，之后用產(chǎn)物并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S943

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本文編號：2632321