【摘要】：生殖生物學(xué)是水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖的重要基礎(chǔ)學(xué)科之一,是人工繁育的重要基礎(chǔ),而性腺發(fā)育與免疫防御機(jī)理又是生殖與免疫研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)是我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物,本論文以該蟹卵黃蛋白原為切入點(diǎn),探討了卵黃蛋白原及其受體的表達(dá)模式與抗菌機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)首先克隆獲得了中華絨螯蟹卵黃蛋白原基因(Es-vtg1)的cDNA全序列,該基因全長(zhǎng)7939 bp,ORF區(qū)包含2567個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),該基因包含三個(gè)結(jié)構(gòu)功能域:LPD_N結(jié)構(gòu)域、DUF1943結(jié)構(gòu)域及VWD結(jié)構(gòu)域。序列比對(duì)顯示,Es-vtg1的結(jié)構(gòu)在甲殼動(dòng)物中是高度保守的。實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot顯示Es-vtg1主要表達(dá)在卵巢、肝胰腺以及血淋巴中,其他組織也有少量表達(dá);血淋巴免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,血淋巴中的Es-vtg1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì),而卵巢組織則主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi),且在發(fā)育期間隨著卵巢的發(fā)育進(jìn)行快速的積累。另外,本實(shí)驗(yàn)克隆獲得了卵黃蛋白原受體(Es-vgr)的cDNA部分序列,熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot結(jié)果顯示,Es-vgr僅在中華絨螯蟹卵巢組織中特異性表達(dá),暗示Es-vgr參與了卵巢發(fā)育過(guò)程;同時(shí)也發(fā)現(xiàn),隨著卵巢的發(fā)育Es-vgr表達(dá)量逐漸升高,在卵巢發(fā)育后期表達(dá)量又有所下降。而Es-vtg1的表達(dá)趨勢(shì)與Es-vgr類(lèi)似,暗示Es-vtg1與Es-vgr共同參與了調(diào)控卵巢發(fā)育過(guò)程。體外干擾中華絨螯蟹卵巢組織Es-vtg1后,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)到Es-vgr的表達(dá)量顯著下降,這一研究結(jié)果暗示了Es-vtg1一定程度可以調(diào)控Es-vgr的表達(dá)。最后,本實(shí)驗(yàn)利用了金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌對(duì)中華絨螯蟹體外培養(yǎng)的血淋巴進(jìn)行了48 h的攻毒實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)Es-vtg1在mRNA水平上的表達(dá)量顯著上升(P0.01),而菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Es-vtg1能夠廣泛性地結(jié)合革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌以及真菌,且含有VWD結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)蛋白能夠抑制菌的生長(zhǎng)。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過(guò)體外干擾中華絨螯蟹血淋巴Es-vtg1,并進(jìn)行菌刺激,結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分抗菌肽表達(dá)量下調(diào)。這些研究結(jié)果表明Es-vtg1具有重要的抗菌功能。
【圖文】：

圖 2.3.1 Es-vtg1 的 cDNA 序列和氨基酸序列分析。核苷酸和氨基酸序列的編號(hào)分別顯示在左邊和右邊。起始密碼子的字體是用綠色表示，終止密碼子的字體用紅色表示的。Poly A 尾（AATAAA）用方框表示。在 Es-vtg1 的 LPD_N 結(jié)構(gòu)域以紅色背景突出顯示，DUF1943 結(jié)構(gòu)域以藍(lán)色背景突出顯示，而 VWD 結(jié)構(gòu)域以綠色背景突出顯示，預(yù)測(cè)的裂解位點(diǎn)序列用下劃線(xiàn)表示。Fig. 2.3.1 Sequence analysis of the cDNA and predicted peptide sequence of Es-vtg1. The numbering of the nucleotide and amino acid sequences is shown to the leftand right, respectively. The start codon is indicated in green and the stop codon isindicated in red; the polyadenylation site (AATAAA) is indicated in a box. The LPD_Ndomain of Es-Vtg1 is highlighted in red, the DUF1943 domain is highlighted in blue,and the VWD domain is highlighted in green. Predicted cleavage site sequences areunderlined.

圖 2.3.2Es-Vtg1 蛋白結(jié)構(gòu)域分析。Es-Vtg1 含有三個(gè)功能性結(jié)構(gòu)域：LPD_N結(jié)構(gòu)域、DUF1943 結(jié)構(gòu)域和 VWD 結(jié)構(gòu)域。Fig.2.3.2 Domain structure analysis of the putative Es-Vtg1 protein, whichincludesthreefunctional domains:anLPD_Ndomain,aDUF1943domain,andaVWDdomain.我們利用 MEGA4.1 進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，，卵黃蛋白原序列來(lái)自 10 個(gè)物種，構(gòu)建方法為 neighbor-joining 法。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示分為兩支， 支為脊椎動(dòng)物，支為無(wú)脊椎動(dòng)物，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果與各物種的進(jìn)化地位 致（圖 2.3.3）。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S917.4

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本文編號(hào)：2632298