【摘要】：造血作用是指未成熟的血淋巴細(xì)胞分化為成熟的血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的過程,其對動物生存起到至關(guān)重要的作用。周期蛋白依賴激酶(CDKs)是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)過程中的核心分子,參與調(diào)節(jié)高等動物的細(xì)胞分裂,細(xì)胞分化,配子形成等生命過程,其與造血系統(tǒng)的互作網(wǎng)絡(luò)引起研究人員的廣泛關(guān)注。目前研究發(fā)現(xiàn),周期蛋白依賴激酶在無脊椎動物中同樣發(fā)揮著重要的作用,但其對無脊椎動物,尤其是甲殼動物造血過程調(diào)控方面的研究十分有限。本論文從甲殼動物的造血過程入手,利用生物化學(xué),細(xì)胞生物學(xué),分子生物學(xué)等技術(shù)手段,以中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)為研究對象,克隆得到了EsCDK2的c DNA序列,分析了其組織與細(xì)胞分布特征和對造血刺激的響應(yīng)模式,對EsCDK2的造血調(diào)節(jié)機(jī)制開展了初步研究。從中華絨螯蟹中鑒定得到一個含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的周期蛋白依賴激酶分子EsCDK2,并對其分子序列及組織分布特征進(jìn)行了分析。EsCDK2的cDNA序列全長2405 bp,含有一個909 bp的開放閱讀框,編碼302個氨基酸。EsCDK2氨基酸序列與其他物種已知的CDK2序列同源性較高,序列相似度為66%-81%。分子進(jìn)化分析表明,EsCDK2能與斑節(jié)對蝦中的CDK2聚為一簇,其親緣關(guān)系較近。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),EsCDK2的mRNA表達(dá)量在血淋巴細(xì)胞中最低,在心臟和肌肉中表達(dá)量較低,而在造血組織和性腺中的表達(dá)量較高,分別是血淋巴細(xì)胞中表達(dá)量的141倍和87倍。通過免疫組化法進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn),EsCDK2在造血組織細(xì)胞的細(xì)胞核和胞漿中均有分布。中華絨螯蟹造血組織細(xì)胞中Es CDK2的mRNA表達(dá)量在脂多糖(2.02倍,p0.05)和嗜水汽單胞菌(2.31倍,p0.05)刺激3小時后顯著上升。血淋巴細(xì)胞總數(shù)在抽血刺激0.5小時后顯著降低(0.39倍,p0.05),達(dá)到0.42×10~7個/毫升,之后逐漸上升并在6小時恢復(fù)至正常水平。利用RNA干擾技術(shù)研究了Es CDK2對于造血組織細(xì)胞增殖的影響。注射Es CDK-dsRNA后24小時,造血組織中EsCDK2的mRNA表達(dá)量顯著降低(0.53倍,p0.01);造血組織細(xì)胞中新生血細(xì)胞占比由37.7%降至16.3%(0.43倍,p0.01),表明隨著EsCDK2被抑制,造血作用顯著減弱。利用流式細(xì)胞儀對造血組織細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn),注射EsCDK2-dsRNA后處于G0-G1時期的細(xì)胞占比顯著上升至85.01%(1.26倍,p0.01),而處于S期和G2-M期的細(xì)胞占比分別顯著下降至7.92%(0.46倍,p0.01)和7.07%(0.43倍,p0.01),表明Es CDK2表達(dá)被抑制后造血組織細(xì)胞的細(xì)胞周期在G1期出現(xiàn)阻滯。綜上,EsCDK2在結(jié)構(gòu)上與高等動物的CDK2相似度較高,主要在造血組織細(xì)胞和性腺細(xì)胞中表達(dá)。在免疫刺激和抽血刺激后,中華絨螯蟹血細(xì)胞總數(shù)顯著降低,造血組織中EsCDK2的m RNA表達(dá)量顯著上升。EsCDK2被干擾后,血細(xì)胞總數(shù)和新生血細(xì)胞數(shù)均顯著降低,且造血組織細(xì)胞的細(xì)胞周期在G1期發(fā)生阻滯,表明EsCDK2通過調(diào)節(jié)造血組織細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)變,參與調(diào)節(jié)中華絨螯蟹的造血過程。研究結(jié)果對深入探索甲殼動物免疫系統(tǒng)的組成和造血作用的調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要的指導(dǎo)意義。
【圖文】：

CDKs 在進(jìn)化上是高度保守的，從低等的真核生物酵母到高等哺乳動物人依賴 CDKs 對細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控，但不同生物細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制相差很如，酵母中只有一種 CDK，而人類以及其他哺乳動物中則有多個 CDK 分子胞周期的不同階段發(fā)揮作用。雖然 CDK 的數(shù)量不同，但細(xì)胞周期的基本調(diào)則是相同的，即 CDK 分子與周期蛋白結(jié)合發(fā)揮細(xì)胞周期調(diào)節(jié)作用，因此 CD泛存在于各個物種當(dāng)中(Lim and Kaldis, 2013)。1.2 CDKs 的分子結(jié)構(gòu)作為典型的 CMGC 激酶家族成員，CDK 屬于脯氨酸引導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨白激酶。由于其結(jié)合脯氨酸的位點(diǎn)附近存在疏水口袋結(jié)構(gòu)，所以 CDK 序列常含有 S/T-P-X-K/R 序列。但 CDK4 分子中不存在疏水口袋結(jié)構(gòu)，因此其序無上述特征序列；CDK7 和 CDK9 并不是脯氨酸引導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白，因此它們可以不依賴脯氨酸而行使磷酸化底物的功能(Echalier et al., 201

第一章 緒論CDKs 的氨基酸序列長度范圍從大約 250 個氨基酸殘基，與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域大小相當(dāng)，到 1500 個氨基酸殘基，除絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域外還擁有不同的 C 端和 N 端序列（圖 1.1）。與其他激酶一樣，CDK 具有雙葉結(jié)構(gòu)，，N 端葉含有大量的 β 折疊，而 C 端葉富含 α 螺旋，活性位點(diǎn)位于兩葉中間。除此之外，其 N 端葉包含一個富含甘氨酸的抑制元件和一個 C 螺旋，其 C端則包含激活元件，例如 CDK2 中的 DFG 結(jié)構(gòu)域，APE 結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點(diǎn)T160(De Vivo et al., 2011)。當(dāng) CDK 未結(jié)合周期蛋白時，其活性區(qū)域被 T 螺旋關(guān)閉，因此不具有激酶活性；當(dāng) CDK 與周期蛋白結(jié)合后，其活性區(qū)域打開，CDK具有了磷酸化底物的活性（圖 1.2）。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院海洋研究所)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 Hai-sheng XU;Sun-jian LYU;Jie-hao XU;Bin-jie LU;Jing ZHAO;Song LI;Yi-qun LI;Yu-yin CHEN;;脂多糖對中華絨螯蟹血細(xì)胞凋亡影響的研究(英文)[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2015年12期

2 史惠蓉;張瑞濤;;P53、P21~(WAF1)和CDK1在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)及意義[J];癌癥;2009年08期

本文編號：2632108