【摘要】：DnaJ蛋白是Hsp40家族的一員,存在于多種生物細(xì)胞內(nèi),是廣泛的脅迫響應(yīng)因子。最初發(fā)現(xiàn)于大腸埃希氏桿菌。DnaJ蛋白是Hsp70的伴侶分子,可以獨(dú)自或協(xié)助Hsp70完成蛋白質(zhì)折疊、解折疊和調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物解聚等功能,對于逆境條件下蛋白質(zhì)或蛋白復(fù)合體的穩(wěn)定的維持具有重要作用。羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)隸屬節(jié)肢動物門(Arthropoda),甲殼動物亞門(Crustacea),十足目(Decapoda),長臂蝦科(Palaemonidae),沼蝦屬(Macrobrachium),原產(chǎn)于印度太平洋地區(qū)。是目前我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)蝦類。但是近年來,由于受到細(xì)菌反復(fù)感染,使蝦類養(yǎng)殖遭受重大挫折。本實(shí)驗(yàn)克隆了羅氏沼蝦四種DnaJ蛋白基因DnaJ A1、DnaJ B6、DnaJ C2及DnaJ C5。并對它們的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,將其分類。利用熒光定量PCR研究了不同組織,溫度脅迫及細(xì)菌脅迫下四種不同Dna J基因的表達(dá)情況,主要結(jié)果如下:(1)分別提取嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)侵染后羅氏沼蝦(L-I)及正常羅氏沼蝦(L-C)的肝臟總RNA。利用Illumina HiSeq高通量測序,并用測序評估、基因注釋等生物信息學(xué)方法進(jìn)行分析。結(jié)果,經(jīng)過測序、轉(zhuǎn)錄本拼接得到46800條contigs;37605個非冗余的Unigenes,其平均長度為1073bp,共有19382個Unigenes得到了成功注釋。豐富和補(bǔ)充了羅氏沼蝦基因組信息。(2)根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序得到的結(jié)果,篩選嗜水氣單胞菌侵染前后表達(dá)差異較大的基因,最終確定本實(shí)驗(yàn)想要研究的基因DnaJ。然后根據(jù)這些已知部分片段設(shè)計(jì)RACE特異性引物,利用GeneRacer~(TM)Kit擴(kuò)增得到cDNA全長。DnaJ A1、DnaJ B6、DnaJ C2和DnaJ C5的cDNA全長分別為1358,999,2319和995 bp,分別編碼397,265,617和259個氨基酸序列,其登錄號分別為:KY924479、KY924480、KY924481及KY924482。通過生物信息學(xué)軟件分析了羅氏沼蝦與其它生物DnaJ基因編碼氨基酸序列的相似性,并根據(jù)比對結(jié)果將這四種DnaJ蛋白進(jìn)行分類。DnaJ A1含有保守的J結(jié)構(gòu)域、C/F結(jié)構(gòu)域、鋅指CR結(jié)構(gòu)域以及羧基末端結(jié)構(gòu)域(CTD),是典型的I型DnaJ蛋白;DnaJ B6含有J結(jié)構(gòu)域和C/F結(jié)構(gòu)域而不含有鋅指結(jié)構(gòu)域,屬于II型DnaJ蛋白;而僅含有保守的J結(jié)構(gòu)域的DnaJ C2和DnaJ C5則屬于Ⅲ型DnaJ蛋白。(4)分別取羅氏沼蝦心臟,鰓,肌肉,腸道,肝臟,卵巢等六種組織,然后提取總RNA,合成cDNA,用于熒光定量表達(dá)分析。qRT-PCR結(jié)果表明:羅氏沼蝦DnaJ A1、DnaJ B6、DnaJ C2和DnaJ C5基因在六種組織中分別都有表達(dá),并且在卵巢組織中都顯著表達(dá)(P0.05),在其他組織中則存在一定的差異性。溫度脅迫選擇了四個梯度:15℃,20℃,25℃,30℃。在這些溫度下都分別誘導(dǎo)1 h,接著提取肌肉和肝臟的總RNA,合成cDNA,用于熒光定量表達(dá)分析。qRT-PCR結(jié)果表明:羅氏沼蝦四種不同DnaJ基因在15℃,20℃,25℃,30℃的肝臟和肌肉中都有表達(dá)。在肝臟中這四種DnaJ基因都對冷脅迫敏感,在15℃和20℃時都顯著表達(dá)(P0.05),對于冷脅迫具有一定的應(yīng)激作用。而在肌肉中則表現(xiàn)出差異性,如DnaJ A1,在15℃時表達(dá)量顯著降低(P0.05),說明低溫脅迫使其表達(dá)量下調(diào);DnaJ B6則在15℃,20℃,30℃時都表現(xiàn)出下調(diào),說明低溫脅迫與高溫脅迫都會使其表達(dá)量發(fā)生下調(diào);DnaJ C2在四個溫度下表達(dá)量無明顯差異(P0.05);而DnaJ C5在15℃時表達(dá)量顯著(P0.05)。這可能與它們的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。為了解四種DnaJ基因在細(xì)菌防御中的作用,用嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)進(jìn)行了細(xì)菌侵染實(shí)驗(yàn)。分別取嗜水氣單胞菌侵染0,1,3,6,9,16,24 h后的肝臟組織,然后提取總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,用于熒光定量表達(dá)分析。熒光結(jié)果顯示在細(xì)菌脅迫后,羅氏沼蝦四種DnaJ基因的表達(dá)量都發(fā)生了顯著的上調(diào)(P0.05),這表明這四種DnaJ基因可能都參與了羅氏沼蝦的細(xì)菌免疫應(yīng)答。但是它們也存在一定的差異性,比如DnaJ A1和DnaJ C2都是在1 h時顯著表達(dá)(P0.05),達(dá)到最大值;而DnaJ B6和DnaJ C5則是在3 h和6 h時顯著表達(dá)(P0.05),并在6 h時到達(dá)峰值;并且就表達(dá)量來說,DnaJ A1和DnaJ C2在嗜水氣單胞菌侵染后表達(dá)量顯著高于DnaJ B6和DnaJ C5,而DnaJ B6的表達(dá)量整體保持在一個較低的水平。這可能與它們的結(jié)構(gòu)有關(guān),結(jié)構(gòu)差異可能是它們表達(dá)量差異的主要原因�？傊�,本次羅氏沼蝦的轉(zhuǎn)錄組測序,幫助我們豐富和補(bǔ)充了羅氏沼蝦基因組信息,具有一定的參考價值。克隆了羅氏沼蝦四種不同DnaJ基因的cDNA全長,并對其不同組織,溫度脅迫及細(xì)菌脅迫情況下的表達(dá)量進(jìn)行分析。不過目前所做的實(shí)驗(yàn)還不夠深入,希望之后可以對DnaJ基因的功能做深入研究,并且本實(shí)驗(yàn)只用了嗜水氣單胞菌作為侵染細(xì)菌,之后可以加入其他細(xì)菌作為研究。
【圖文】：

（1）J 結(jié)構(gòu)域：一般由 70 多個氨基酸組成，然后通過 4 個 α-螺旋組形成空間結(jié)構(gòu)，該空間結(jié)構(gòu)上的 α-螺旋能夠與 Hsp70 上的 ATPase 聯(lián)合作用[28,29]。并且該空間結(jié)構(gòu)上存在由脯氨酸、組氨酸和天冬氨酸構(gòu)成的高度保守 HPD 模塊[30-34]，學(xué)者證實(shí) DnaJ 蛋白和 Hsp70 的相互作用必須依靠于此模塊[35]。（2）（G/F）結(jié)構(gòu)域：在此結(jié)構(gòu)域上有大量的苯丙氨酸以及甘氨酸。此結(jié)構(gòu)域的主要作用就是維持 DnaJ 蛋白和 Hsp70 能夠正常的作用[36-39]，但是研究指出如果（G/F）結(jié)構(gòu)域上發(fā)生了氨基酸的缺失也不會有什么影響[40]。（3）鋅指（CR）結(jié)構(gòu)域：該結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)，DNA 以及 RNA 都能發(fā)生相互作用，主要原因是其結(jié)構(gòu)域上有 4 個重復(fù)序列[41,42]，因此鋅指（CR）結(jié)構(gòu)域使得 DnaJ 蛋白不同的功能。例如有學(xué)者指出斑馬魚 zf-Hsp40 蛋白有助于的斑馬魚的損傷修復(fù)[43]。（4）羧基末端結(jié)構(gòu)域（CTD）：相較于其他 3 個結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域最為不保守。它的主要功能是使 DnaJ 蛋白與相對應(yīng)的底物擁有更強(qiáng)的結(jié)合能力，并保證了作用的特異性[44-46]。該結(jié)構(gòu)域通常以二聚體，或者四聚體的形式使 DnaJ 蛋白和 Hsp70 發(fā)生作用。

圖 1.2 DnaJ 蛋白的分類Fig.1.2 Types of DnaJ proteinsA：I 類型 DnaJ 蛋白；B：II 類型 DnaJ 蛋白；C：III 類型 DnaJ 蛋白。.3 DnaJ 蛋白的作用原理DnaJ 蛋白和 Hsp70 的相互作用主要是通過作用于 Hsp70 上的 ATPase，使得Pase 的活性大大增加。因?yàn)?ATPase 能夠與 ADP 和 ATP 結(jié)合，但是與 ATP 結(jié)的 Hsp70 與所對應(yīng)底物結(jié)合的能力較差，，而與 ADP 結(jié)合的 Hsp70 與所對應(yīng)的物結(jié)合的能力卻較強(qiáng)[49]，而 DnaJ 蛋白正是通過增大 ATPase 的活性，使 Hsp70多的轉(zhuǎn)變?yōu)榕c ADP 結(jié)合的形態(tài)[50]，從而達(dá)到讓 Hsp70 與所對應(yīng)底物結(jié)合結(jié)合力增強(qiáng)的效果，并且該作用機(jī)制增強(qiáng)了結(jié)合的特異性。不同的 DnaJ 蛋白所用的方式也不盡相同，例如某些 DnaJ 蛋白先直接作用底物，再激活Hsp70上的ATPase[51-53]。也有一些DnaJ蛋白并不能作用于底物，通過高度聚集的 DnaJ 蛋白在固定位置，來提高該位置的 Hsp70 的濃度，從而快 Hsp70 與底物的結(jié)合[54,55]；除以上兩張作用方式以外另一種 DnaJ 蛋白和
【學(xué)位授予單位】：中國計(jì)量大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4;Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2630772