【摘要】：本研究對(duì)異育銀鯽“喉孢子蟲病”病原—洪湖碘泡蟲(Myxobolus honghuensis Liu et Gu,2012)的免疫原性進(jìn)行了一系列研究,制備出多克隆抗體和單克隆抗體。旨在為建立準(zhǔn)確、高效的洪湖碘泡蟲免疫學(xué)檢測方法提供有效工具以及疫苗的開發(fā)提供重要候選抗原信息,從而為“喉孢子蟲病”的免疫學(xué)防控打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:1.洪湖碘泡蟲多克隆抗體的制備及免疫特性分析本研究利用蔗糖密度梯度離心法分離純化洪湖碘泡蟲,經(jīng)反復(fù)凍融、液氮研磨提取可溶性蛋白,免疫小鼠制備得到多克隆抗體,并采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFAT)、免疫印跡分析(Western blotting)對(duì)多克隆抗體的免疫特性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,間接ELISA法測定多抗血清的效價(jià)為1:25600;IFAT熒光定位顯示洪湖碘泡蟲的抗原主要位于極絲、孢子殼瓣的四周及底部一特定位置;Western blotting印記分析顯示該多抗血清與洪湖碘泡蟲可溶性蛋白中約10條帶發(fā)生反應(yīng),該可溶性蛋白中具有免疫原性的蛋白分子量大小分別約為180 k Da,130 k Da,78 k Da,75 k Da,62 k Da,52 k Da,42 k Da,36 k Da,34 k Da,28 k Da。該多抗血清與碘泡蟲屬及單極蟲屬的一些粘孢子蟲種類存在一定程度的交叉反應(yīng)。2.洪湖碘泡蟲殼瓣和極絲單克隆抗體的制備與鑒定本研究利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)最終篩選得到兩株有效抗洪湖碘泡蟲的單克隆抗體1C7和3B7。結(jié)果顯示,間接ELISA法測定效價(jià)分別為1:124000、1:248000,1C7和3B7的亞型分別為Ig M和Ig G1;IFAT定位抗原:單抗1C7特異識(shí)別極絲,單抗3B7特異識(shí)別成熟孢子殼瓣,兩者均不與蟲體其它結(jié)構(gòu)發(fā)生反應(yīng);Western blotting顯示:1C7結(jié)合抗原的相對(duì)分子質(zhì)量約為130Kda和180Kda,3B7結(jié)合抗原的相對(duì)分子質(zhì)量約為28Kda。通過對(duì)兩株單抗所結(jié)合的蛋白進(jìn)行MS質(zhì)譜分析并與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Uni Prot)比對(duì)的結(jié)果顯示:1C7對(duì)應(yīng)的蛋白可能為BCLF1蛋白(Bcl-2-associated transcription factor 1),3B7對(duì)應(yīng)的蛋白為ANGI_AOTTR蛋白。
【圖文】：

的洪湖碘泡蟲（圖Ⅱ-1A），蟲體經(jīng)過凍融和破碎處理后（圖Ⅱ-1B）得到洪湖碘泡蟲可溶性蛋白可作為免疫動(dòng)物的抗原。圖Ⅱ-1 洪湖碘泡蟲光鏡圖.A 純化后蟲體；B 破碎后蟲體Fig.Ⅱ-1 Light photomicrograph of M. honghuensis.A. purified spores; B. disrupted spores2. 2 可溶性蛋白制備及 SDS-PAGE 分析分離純化的洪湖碘泡蟲經(jīng)過反復(fù)凍融、液氮研磨后，離心得到洪湖碘泡蟲的可溶性蛋白，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法測得可溶性蛋白的濃度為 0.511mg/mL。對(duì)所得洪湖碘泡蟲可溶性蛋白濃度進(jìn)行適當(dāng)稀釋后進(jìn)行 SDS-PAGE 分析（圖Ⅱ-2），可溶性蛋白在 SDS-PAGE 電泳中主要分布于 17~180kDa 之間，主要蛋白條帶大小分別為 56 kDa，52 kDa，，48 kDa，42 kDa

的洪湖碘泡蟲（圖Ⅱ-1A），蟲體經(jīng)過凍融和破碎處理后（圖Ⅱ-1B）得到洪湖碘泡蟲可溶性蛋白可作為免疫動(dòng)物的抗原。圖Ⅱ-1 洪湖碘泡蟲光鏡圖.A 純化后蟲體；B 破碎后蟲體Fig.Ⅱ-1 Light photomicrograph of M. honghuensis.A. purified spores; B. disrupted spores2. 2 可溶性蛋白制備及 SDS-PAGE 分析分離純化的洪湖碘泡蟲經(jīng)過反復(fù)凍融、液氮研磨后，離心得到洪湖碘泡蟲的可溶性蛋白，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法測得可溶性蛋白的濃度為 0.511mg/mL。對(duì)所得洪湖碘泡蟲可溶性蛋白濃度進(jìn)行適當(dāng)稀釋后進(jìn)行 SDS-PAGE 分析（圖Ⅱ-2），可溶性蛋白在 SDS-PAGE 電泳中主要分布于 17~180kDa 之間，主要蛋白條帶大小分別為 56 kDa，52 kDa，48 kDa，42 kDa
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S941.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 章晉勇;圓形碘孢蟲抗原性及與宿主相互作用研究[D];中國科學(xué)院研究生院（水生生物研究所）;2006年

本文編號(hào)：2620256