【摘要】：鯉春病毒血癥病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV),是鯉春病毒血癥(Spring viremia of carp,SVC)的病原。SVC對鯉科魚類養(yǎng)殖業(yè)危害巨大,且其致病機理尚不明確,國際動物衛(wèi)生組織(OIE)將SVC定為必須上報的魚類疾病之一,我國農(nóng)業(yè)部也將SVC定為一類動物疫病。細胞凋亡是細胞應對多種刺激的一種主動、高度有序的細胞程序性死亡過程,對維持機體內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。為了解SVCV的致病機理,本研究對SVCV感染細胞后病毒在細胞內(nèi)的增殖情況及SVCV誘導細胞凋亡機制進行初步探究。首先通過對EPC、CO兩種細胞進行病毒感染,對比TCID_(50)測定結果,選擇最佳敏感細胞進行后續(xù)試驗;通過建立SVCV-G蛋白標準曲線,利用qRT-PCR方法對SVCV作用敏感細胞不同時間后病毒增殖檢測,探究病毒的增殖與細胞病變存在的關系。結果表明:相對于CO細胞,EPC細胞對SVCV更加敏感;qRT-PCR檢測,培養(yǎng)8 h后病毒量明顯增加,在64 h處達到峰值,與對感染細胞進行形態(tài)發(fā)生觀察時16-32 h細胞開始出現(xiàn)拉網(wǎng)、脫落等明顯病變一致。其次利用Hoechst 33258和透射電鏡(TEM)對感染連續(xù)培養(yǎng)64 h的細胞進行細胞形態(tài)發(fā)生觀察,初步驗證SVCV誘導細胞發(fā)生凋亡。通過Annexin V-FITC/PI雙染法經(jīng)流式細胞術對感染不同時間點細胞進行凋亡檢測和利用抑制劑對caspase-3、8、9表達量進行檢測;利用CytoTox 96非放射性細胞毒性檢測法,檢測感染SVCV的EPC后培養(yǎng)液中LDH的濃度,間接反映出細胞的存活率。結果表明:Hoechst33258染色發(fā)現(xiàn)感染SVCV的EPC細胞出現(xiàn)細胞核結構濃染,發(fā)出較強熒光的核碎片等現(xiàn)象,透射電鏡可見染色質(zhì)向邊緣凝集,并逐步向胞質(zhì)脫離,最終形成凋亡小體等一系列細胞凋亡典型表征,證實SVCV可以誘導EPC細胞發(fā)生凋亡;通過Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡,感染病毒后32-64h凋亡程度顯著增加;caspase-3的表達量隨病毒作用時間不斷增加,到8 h達到峰值,之后逐漸下降。caspase-8的表達量隨時間增加,8 h時表達量達到最高,之后表達量不斷降低。caspase-9的表達量變化與caspase-3、8的變化規(guī)律大體相同,都存在時間依從性,培養(yǎng)到16 h時caspase-9表達量最高;CytoTox 96非放射性細胞毒性檢測培養(yǎng)8 h時,對比未感染組LDH濃度明顯增加,培養(yǎng)16 h后,尤其是32 h、64 h,感染組的LDH遠遠高于對照組。本試驗初步探究了SVCV感染后對EPC細胞的影響,驗證了該病毒可以誘導EPC細胞發(fā)生凋亡,對病毒增殖和細胞凋亡的測定確定了病毒作用細胞的活躍時間段,根據(jù)caspase-3、8、9表達量上調(diào)這一發(fā)現(xiàn),推斷SVCV誘導細胞凋亡存在兩種凋亡通路且同時發(fā)生。這些試驗為SVCV誘導EPC細胞凋亡的機制研究奠定了基礎,為進一步對SVCV致病機理的研究提供了方向,為SVC的治療、用藥和防控提供了一定的理論依據(jù)。
【圖文】：

1.4 SVCV 蛋白組成鯉春病毒基因線性不分段，包括 5 個主要的開放閱讀框（ORFs），它們按照彈狀病毒典型的排列順序排列，分別可編碼：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和依賴性 RNA 聚合酶（L）（見圖 1.1）[10]。其中，，核蛋白（N）是病毒粒子核衣殼的重要組成蛋白，在 SVCV 的多種主要蛋白中表達量最高，對病毒的轉錄與調(diào)控有至關重要的作用；磷蛋白（P）實際檢測含量較少，在病毒粒子的轉錄過程中起到積極意義，是核衣殼組成中不可缺少的一種蛋白；基質(zhì)蛋白（M）參與病毒粒子的組裝，可抑制宿主細胞轉錄的過程，從而改變細胞的骨架；糖蛋白（G）存在糖基化，在病毒的出芽成熟和侵入宿主細胞的過程發(fā)揮了重要的作用[16]，同時又有很強的免疫原性，是鯉春病毒重要的抗原；依賴性 RNA 聚合酶（L）可以催化病毒粒子的復制和轉錄，在 20-25℃時，依賴性 RNA 聚合酶活性達到最大。

表 1-6 TCID50測定結果Tab 1-6 Measurement results of TCID50稀釋倍數(shù)s dilutionEPC 出現(xiàn) CPE 孔數(shù)The appear CPE holes of EPCCO 出現(xiàn) CPE The appear CPE ho10-18/8 8/810-28/8 8/810-38/8 4/810-48/8 1/810-55/8 0/810-63/8 0/810-70/8 0/8 小時后 EPC、CO 細胞 CPE 圖：A. 正常狀態(tài) EPC (200×) B.出現(xiàn) CPC. 正常狀態(tài) CO (200×) D. 出現(xiàn) CPE 的 CO (200×)24 hours after infection EPC、CO cells: A. Normal state EPC (200×) B. TEPC (200×) C. Normal state CO (200×) D. The appear CPE of CO (200
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S943

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 陳珍容;陳進會;陳洵;唐大運;石磊;顏其貴;;3種魚類彈狀病毒熒光定量環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立[J];中國預防獸醫(yī)學報;2015年11期

2 王津津;賈鵬;史秀杰;于力;阮周曦;鄭曉聰;何俊強;蘭文升;宋思靜;劉葒;;流式細胞儀在快速測定鯉春病毒血癥病毒滴度中的應用[J];中國動物檢疫;2015年09期

3 吳斌;申翠翠;張晨曦;胡德聰;肇慧君;張琳;;數(shù)字RT-PCR檢測鯉春病毒血癥的方法建立與應用[J];中國動物檢疫;2015年07期

4 柴路維;伊宏亮;蔡敏;包華瓊;;精子DNA損傷檢測技術的研究進展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2015年18期

5 任玉偉;宿華威;;Bcl-2基因家族研究進展[J];大連醫(yī)科大學學報;2015年02期

6 王姝;曹歡;王小亮;王靜波;徐立蒲;;鯉春病毒血癥監(jiān)測方法的應用研究[J];檢驗檢疫學刊;2014年06期

7 劉海生;張永強;趙永剛;吳延功;王清華;任煒杰;呂艷;劉春菊;王志亮;單虎;;BVDV 1型和2型焦磷酸測序檢測方法的建立[J];中國獸醫(yī)雜志;2014年07期

8 李敏;林俊;;細胞凋亡途徑及其機制[J];國際婦產(chǎn)科學雜志;2014年02期

9 聶青和;朱婷;;維持肝衰竭內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的臨床實踐[J];實用肝臟病雜志;2014年02期

10 尹偉力;方紹慶;劉寧;岳志芹;劉葒;耿金培;許紅巖;;鯉春病毒血癥病毒新型液相芯片檢測技術的建立[J];中國獸醫(yī)學報;2013年12期

相關博士學位論文 前4條

1 俞瑾;調(diào)控線粒體形態(tài)與功能恢復高糖狀態(tài)下七氟醚后處理心肌保護作用的機制研究[D];新疆醫(yī)科大學;2017年

2 康愷;豬瘟病毒復制與細胞自噬關系的研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2015年

3 王斌;遲緩愛德華氏菌易感細胞模型的建立及病原菌—宿主細胞互作研究[D];中國海洋大學;2013年

4 陳紅蓮;狗魚幼魚彈狀病毒的特性、基因組測序及分子生物學檢測技術研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2009年

相關碩士學位論文 前7條

1 王華欣;BVDV與IBRV感染MDBK細胞的病毒復制與細胞凋亡研究[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學;2017年

2 郭茜茜;細胞凋亡不同階段檢測凋亡率的最佳方法研究[D];遼寧醫(yī)學院;2015年

3 李俊超;錦鯉皰疹病毒誘導的細胞凋亡與抗病毒藥物篩選[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2014年

4 劉婷;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路在十溴聯(lián)苯醚致小鼠海馬神經(jīng)元細胞系HT-22細胞凋亡中作用[D];安徽醫(yī)科大學;2014年

5 農(nóng)彩麗;青天葵黃酮類化合物A和B對人肺癌H460細胞體外抗腫瘤活性及機制研究[D];廣西醫(yī)科大學;2013年

6 張曉娜;AIV，NDV，IBV和ILTV液相檢測芯片方法的建立[D];南京農(nóng)業(yè)大學;2012年

7 劉伍梅;PRRSV感染Marc-145細胞的病毒形態(tài)發(fā)生學、細胞超微結構變化及細胞凋亡的研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2005年

本文編號：2620058