【摘要】：近十年來,隨著世界各地耐藥現(xiàn)象的頻頻發(fā)生,細(xì)菌耐藥已經(jīng)引起了世界各國人民的廣泛關(guān)注,也成為了當(dāng)前最熱門的科學(xué)研究之一。海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖作為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)重要的養(yǎng)殖方式之一,為人們提供美味、營養(yǎng)的海產(chǎn)品的同時(shí),也為我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了重要的貢獻(xiàn)。華南沿海地區(qū)是我國海水魚養(yǎng)殖的密集之地,其養(yǎng)殖規(guī)模大、歷史悠久、品種繁多,且病害情況復(fù)雜、發(fā)病率高、死亡率高。由于當(dāng)前缺乏對(duì)獸用抗生素的有效監(jiān)管和使用指導(dǎo),使得水產(chǎn)養(yǎng)殖活動(dòng)上的抗生素濫用、誤用現(xiàn)象嚴(yán)重。這不僅會(huì)導(dǎo)致海水環(huán)境的日趨惡化以及水產(chǎn)品中藥物殘留嚴(yán)重,更為嚴(yán)重的是致使耐藥性病原菌(Antibiotic-resistant bacteria,ARB)的出現(xiàn)。細(xì)菌的耐藥性可以通過耐藥基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)進(jìn)行水平傳播和垂直傳播,對(duì)環(huán)境安全、食品安全及人類健康都造成了巨大的威脅。本研究分別在苗期(4月份)、飼養(yǎng)期(7月份)、捕撈期(10月份)對(duì)海南省六個(gè)主要海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)文昌市會(huì)文鎮(zhèn)(HW)、萬寧市和樂鎮(zhèn)(HL)、陵水(LS)、三亞市鐵爐港(TLG)、儋州市海頭港(HTG)、臨高縣(LG)和廣東省七個(gè)主要海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)潮州市饒平(RP)、惠州市鹽洲島(YZD)、深圳市大亞灣(DYW)、珠海市桂山島(GSD)、陽江市海陵島(YJ)、湛江市南三島(ZJ)、揭陽市流沙鎮(zhèn)(LS)的ARB和ARGs分布進(jìn)行了采樣調(diào)查。分別采用藥物平板篩選法和熒光定量技術(shù)對(duì)海水養(yǎng)殖環(huán)境中ARB和ARGs的豐度及多樣性進(jìn)行表征。揭示了各海水養(yǎng)殖區(qū)和不同養(yǎng)殖時(shí)期ARB和ARGs的豐度分布情況,掌握了ARB和ARGs豐度隨時(shí)空變化的規(guī)律。通過結(jié)合環(huán)境因子、ARB、ARGs進(jìn)行冗余分析(RDA analysis),探明了環(huán)境因子、ARB和ARGs之間的相關(guān)性。在此調(diào)查基礎(chǔ)上,通過對(duì)V.harveyi 345進(jìn)行體外誘導(dǎo),成功獲得了哈維弧菌對(duì)環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)的耐藥株,利用重測序技術(shù)對(duì)原始菌株及不同抗性水平的誘導(dǎo)株進(jìn)行比較基因組分析,找到了導(dǎo)致哈維弧菌對(duì)喹諾酮類藥物耐藥可能的變異位點(diǎn),為探尋哈維弧菌對(duì)喹諾酮類耐藥機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。本研究主要研究結(jié)果如下:(1)ARB和ARGs廣泛分布于海南省各海水魚類網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)。各養(yǎng)殖時(shí)期ARB濃度在5.5×10~1~2.6×10~4 CFU/mL之間,苗期阿莫西林(Amoxicillin,AMO)和慶大霉素(Gentamicin,GEN)細(xì)菌耐藥率最高,在HW海區(qū)高達(dá)100%;而飼養(yǎng)期和捕撈期土霉素(Oxytetracycline,OT)細(xì)菌耐藥率較高。不同海區(qū)細(xì)菌耐藥率具有顯著性差異(p0.05),總體來看,HW海區(qū)細(xì)菌耐藥率較高,而TLG、HTG和LG海區(qū)細(xì)菌耐藥率普遍偏低。從ARB多樣性來看,苗期327株ARB被鑒定為32個(gè)屬,而交替單胞菌屬(Alteromonas)和弧菌屬(Vibrio)分別占比32.72%和24.77%,為優(yōu)勢(shì)ARB;飼養(yǎng)期和捕撈期共715株ARB被鑒定為24個(gè)屬,Vibrio(76.64%)為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)ARB;而在門類水平上,各養(yǎng)殖時(shí)期都以變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢(shì)門類。13種ARGs除tetS、ermA和ermB未檢出,其余ARGs全部檢出�？傮w來看,sul家族基因豐度要高于tet家族基因豐度,且sul2、sul1、sul3在每個(gè)采樣位點(diǎn)都被檢出。但不同采樣時(shí)期,其優(yōu)勢(shì)ARGs出現(xiàn)了明顯的替換現(xiàn)象。從時(shí)空變化來看,捕撈期ARGs豐度顯著高于飼養(yǎng)期(p0.05);HW和HTG海區(qū)ARGs總相對(duì)豐度顯著高于其它海區(qū)(p0.05);RDA分析發(fā)現(xiàn),大部分ARGs、ARB與溶氧量(Dissolved oxygen,DO)、pH呈正相關(guān),與鹽度呈負(fù)相關(guān),溫度對(duì)ARGs和ARB貢獻(xiàn)較小。(2)廣東省各海水魚類網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)中ARB數(shù)量在0-3.94×10~4 CFU/mL之間,除OT耐藥菌數(shù)量在10~2-10~4 CFU/mL,其他抗生素ARB數(shù)量在0-10~2 CFU/mL之間。從細(xì)菌耐藥率來看,除OT耐藥率外(均約34.15%),其他類型的抗生素的細(xì)菌耐藥率在每個(gè)養(yǎng)殖區(qū)都很低(均約1.15%)�？傮w來看,ARB數(shù)量及耐藥率隨時(shí)空變化均無顯著性差異(p0.05)。從ARB多樣性來看,577株ARB被鑒定為40個(gè)屬,飼養(yǎng)期多樣性指數(shù)苗期多樣性指數(shù)捕撈期多樣性指數(shù)。Vibrio(50.95%)為三個(gè)養(yǎng)殖時(shí)期的優(yōu)勢(shì)ARB,Proteobacteria為優(yōu)勢(shì)門類。13種ARGs中,除tetS、tetA外,其它11種ARGs全部被檢出,sul1為sul家族中的優(yōu)勢(shì)ARGs,tetB為tet家族中的優(yōu)勢(shì)ARGs,ermB為erm家族中的優(yōu)勢(shì)ARGs,而總的ARGs豐度則是:sulteterm。隨著時(shí)空變化,捕撈期的ARGs豐度顯著性高于苗期和飼養(yǎng)期(p0.01),且RP海區(qū)ARGs豐度顯著性高于DYW和LS(p0.01),GSD海區(qū)ARGs豐度顯著高于DYW(p0.05)。RDA分析發(fā)現(xiàn),溫度(WT)與大多數(shù)ARGs和ARB呈現(xiàn)正相關(guān),而DO和pH與大多數(shù)ARGs呈負(fù)相關(guān),僅與sul2和tetM呈正相關(guān);鹽度與大多數(shù)ARGs呈正相關(guān)�？傮w來看,WT、pH、鹽度對(duì)ARGs和ARB的豐度變化都有著很大的貢獻(xiàn)。(3)通過CIP體外誘導(dǎo),成功獲得4株不同耐藥水平的耐藥株,分別為345-CIP_(50)、345-CIP_(180)、345-CIP_(20g)、345-CIP_(300),與原始菌株F_0相比,各耐藥株對(duì)CIP的最小抑菌濃度(Minimal inhibit concentration,MIC)分別提升了64、256、256、128倍。這些耐藥株對(duì)諾氟沙星(Norfloxacin,NOR)和恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR)發(fā)生了顯著的交叉帶藥現(xiàn)象(4 MIC),且獲得的誘導(dǎo)株對(duì)NOR的MIC普遍高于CIP一倍。此外,獲得的不同耐藥水平的耐藥株對(duì)氟苯尼考(Florfenicol,FFC)的MIC值分別發(fā)生了不同倍數(shù)的下降。通過在無抗培養(yǎng)基中傳代20代的耐藥株345-CIP_(20g)耐藥表型發(fā)生了輕微回復(fù)。通過不同耐藥水平的耐藥株的生長速率比較發(fā)現(xiàn),菌株的耐藥水平與生長速率呈顯著性負(fù)相關(guān)(p0.01)。(4)以原始菌株V.harveyi 345為參考基因組,對(duì)345-CIP_(50)、345-CIP_(300)進(jìn)行重測序,比較基因組分析發(fā)現(xiàn):與耐藥相關(guān)的變異發(fā)生于ATP結(jié)合盒家族(ATP-binding cassette,ABC)中的鋅吸收系統(tǒng)膜蛋白ZnuB、喹諾酮類耐藥決定區(qū)GyrA、雙組份系統(tǒng)中OmpR家族中的組氨酸蛋白激酶EnvZ、LuxR家族中編碼組氨酸激酶TtrS及群體感應(yīng)系統(tǒng)中的跨膜蛋白YscT,SctT,HrcT,表明這些蛋白對(duì)細(xì)菌耐藥具有重要作用�？傮w來看,兩株不同抗性水平的菌株的SNP變異基本一致,未發(fā)現(xiàn)345-CIP_(300)有特殊的與耐藥相關(guān)的SNP。通過InDel分析發(fā)現(xiàn),外膜孔道蛋白OmpA和OmpF、趨化蛋白CheW及AcrAB-TolC外排系統(tǒng)中的AcrA蛋白基因組上的變異均與耐藥相關(guān),推測這些變異可能是導(dǎo)致細(xì)菌高水平耐藥的主要原因。
【圖文】：

圖 1-1 ARB 和 ARGs 在人-動(dòng)物-環(huán)境之間的傳播途徑[8]Fig 1.1 Dissemination of drug-resistant bacteria/drug resistance genes inhuman-animal-environment1.1.2 環(huán)境中 ARB 的分布及多樣性

海南省采樣位點(diǎn)分布圖
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S948;S967.3

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本文編號(hào)：2619677