【摘要】：縊蟶具有很高的經(jīng)濟價值,其養(yǎng)殖的歷史悠久。分子標(biāo)記輔助育種較傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式,能大大提高縊蟶養(yǎng)殖的效率。建立高密度縊蟶遺傳連鎖圖譜,能對縊蟶分子輔助育種起到有效的幫助。本實驗在開發(fā)了微衛(wèi)星標(biāo)記和SLAF標(biāo)記的基礎(chǔ)上,建立了縊蟶家系親子鑒定技術(shù),構(gòu)建了縊蟶遺傳圖譜。主要研究內(nèi)容如下:1.通過磁珠富集對微衛(wèi)星文庫進行構(gòu)建,設(shè)計并開發(fā)400對引物,篩選并合成了30對微衛(wèi)星引物,用12個縊蟶個體對18個微衛(wèi)星引物進行多態(tài)性分析。18對微衛(wèi)星引物在12個個體中等位基因為2~6,平均每對等位基因為3.00,位點G_ScSSR110等位基因最多,為6個;觀測雜合度在0.000~1.000之間,平均值為0.5813;期望雜合度0.290~0.779,平均值為0.5284;多態(tài)信息含量為0.239~0.703,平均值0.4322。選取其中8對多態(tài)性較高的引物,對作圖家系進行親子鑒定,8個微衛(wèi)星位點的親子標(biāo)記排除率,當(dāng)兩個親本基因型未知的情況下,單個親本排除率(E-1P)為0.583~0.916,平均值為0.7900;當(dāng)一個親本基因型已知的情況下,另一個親本的排除率(E-2P)為0.406~0.830,平均值為0.6539。排除錯配在1對引物以上的子代個體,鑒定出其中154個個體屬于同一家系。2.通過磁珠富集法開發(fā)并了400對引物,通過篩選得到30個多態(tài)性標(biāo)記;同時搜索EST庫得到2010個微衛(wèi)星引物序列,篩選五核苷酸、四核苷酸、三核苷酸序列得429個標(biāo)記,對其基因組位點分析得到144個多態(tài)性標(biāo)記。整合磁珠富集法和EST庫中得到的微衛(wèi)星引物共174對,剔除純合微衛(wèi)星標(biāo)記,作圖標(biāo)記129個,上圖標(biāo)記70個,圖遺傳圖譜長度為400.94 cM,連鎖群長度范圍0.91~60.66 cM;平均距離為10.97 cM,譜覆蓋率為8.8%。3.利用SLAF-seq技術(shù)建立SLAF文庫,開發(fā)315533個SLAF標(biāo)記,多態(tài)性SLAF標(biāo)記共有144920個,多態(tài)性比例達到45.93%。根據(jù)基因型編碼規(guī)則對本實驗獲得的144920個多態(tài)性SLAF標(biāo)記編碼基因型,有96655個標(biāo)記成功編碼。篩選出的8212個SLAF標(biāo)記,共上圖7516個,上圖率為91.52%,最終得到總圖距2383.85 cM的遺傳圖譜,每條連鎖群上標(biāo)記的遺傳平均距離為0.27 cM。19條連鎖群的雄性遺傳圖譜,上圖標(biāo)記4189個,平均每個連鎖群包含220個標(biāo)記,連鎖群標(biāo)記范圍61~389個;圖譜總長度1815.64 cM,連鎖群上標(biāo)記的遺傳平均距離為0.44 cM。雌性圖譜上圖標(biāo)記4180個,平均每個連鎖群包含220個標(biāo)記,連鎖群標(biāo)記范圍55~427個;圖譜總長度2731.31 cM,連鎖群長度范圍在90.30~207.10 cM,連鎖群上標(biāo)記的遺傳平均距離為0.78cM。將SSR標(biāo)記與SNP標(biāo)記進行整合得到縊蟶中性高密遺傳連鎖圖譜,共上圖7637個,總圖距為2345.50 cM,連鎖群長度范圍在65.53~167.41 cM,連鎖群上標(biāo)記的遺傳平均距離為0.31 cM。雄性遺傳圖譜,上圖標(biāo)記4281個,圖譜總長度1693.33 cM,連鎖群長度范圍在82.68~211.15 cM,連鎖群上標(biāo)記的遺傳平均距離為0.40 cM。雌性圖譜上圖標(biāo)記4266個,圖譜總長度2884.64 cM,連鎖群長度范圍在82.68~211.15 cM,連鎖群上標(biāo)記的遺傳平均距離為0.68 cM。
【圖文】：

圖 2-1 基因組 DNA 凝膠電泳圖Fig.2-1 Genomic DNA2.2.2 引物設(shè)計結(jié)果經(jīng)過磁珠富集，在縊蟶微衛(wèi)星文庫中得到605個陽性克隆并測序，再PrimerSelect軟件對測序結(jié)果進行引物設(shè)計，最后設(shè)計得到微衛(wèi)星引物400對。2.2.3 微衛(wèi)星引物篩選結(jié)果用 Sequencher 軟件對五核苷酸、四核甘酸、三核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星序列，進去除接頭及載體序列的操作，設(shè)計并合成引物 50 對。用 3 個縊蟶基因組 DNA 普通引物進行 PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物用 2%瓊脂糖凝膠電泳對進行檢測，結(jié)果其20 對引物有明顯清晰的條帶。送上海邁浦生物有限公司，用 FAM 和 HEX 兩種光基團對這 20 對引物 5 端進行修飾，合成熒光引物。得到的 20 對熒光引物，

圖 2-2 部分微衛(wèi)星引物初步篩選凝膠電泳圖Fig.2-2 Microsatellite primers gel electrophoresis2.2.4 微衛(wèi)星多態(tài)性引物對群體遺傳評估分析用 Cervus 3.0 對這 18 對引物進行進行遺傳多樣性分析。 結(jié)果顯示，18 對衛(wèi)星引物在 12 個個體中等位基因為 2～6，平均每對等位基因為 3.00，位G_ScSSR110 等位基因最多，為 6 個；觀測雜合度在 0.000～1.000 之間，平均值0.5813；期望雜合度 0.290～0.779，平均值為 0.5284；多態(tài)信息含量為 0.239～0.70平均值 0.4322。并且當(dāng)兩個親本基因型未知的情況下，單個親本排除率（E-1為 0.658～0.961，，平均值為 0.8409；當(dāng)一個親本基因型已知的情況下，另一個親排除率（E-2P）為 0.479～0.880，平均值為 0.7291。當(dāng)一個微衛(wèi)星標(biāo)記在各個位的親緣排除率越高時，則說明該標(biāo)記適合用于家系的親子鑒定。引物信息見表 218 對縊蟶微衛(wèi)星引物遺傳參數(shù)見表 2-2。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：2611042