【摘要】：紅細(xì)胞,特別是低等脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞,除了能夠完成氣體運(yùn)輸外,可能在免疫、代謝中發(fā)揮重要功能。本文以尼羅羅非魚為動(dòng)物模型,觀察尼羅羅非魚紅細(xì)胞和白細(xì)胞的形態(tài)及成熟紅細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器的分布,檢測(cè)羅非魚紅細(xì)胞中基因的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)挑選平均體重在200±10g的尼羅羅非魚,借助Ficoll離心法分離紅細(xì)胞及白細(xì)胞,使用吉姆薩-瑞氏染色法及熒光染色法分別對(duì)羅非魚紅細(xì)胞和白細(xì)胞進(jìn)行染色,并通過(guò)顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)。羅非魚全血中紅細(xì)胞占多數(shù),紅細(xì)胞形狀為橢圓形,有一個(gè)近圓形的細(xì)胞核,位于細(xì)胞的中央。而白細(xì)胞數(shù)量較少,且形狀不規(guī)則。純化后的白細(xì)胞形態(tài)不一,由多種細(xì)胞構(gòu)成。使用細(xì)胞分離液的分離效果較好,紅細(xì)胞的比例高于99%,而白細(xì)胞的比例則大于95%。使用熒光染料處理羅非魚紅細(xì)胞以觀察活體細(xì)胞器(溶酶體和線粒體),結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者在細(xì)胞質(zhì)中分布均勻。結(jié)果表明,羅非魚成熟紅細(xì)胞仍然具有細(xì)胞核和一些類型的細(xì)胞器,細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。而這些完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu),使得羅非魚紅細(xì)胞有可能具有轉(zhuǎn)錄和翻譯蛋白質(zhì)等細(xì)胞生物學(xué)功能。完成紅白細(xì)胞分離后,借助高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)羅非魚紅細(xì)胞和白細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)定及生物信息學(xué)分析。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)通過(guò)篩選后分別得到4.24G和4.18G數(shù)據(jù)量。兩端測(cè)序的總reads數(shù)均為14149487。樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估為:白細(xì)胞clean data的Q20達(dá)到96.04%,而Q30為88.54%;紅細(xì)胞clean data的Q20達(dá)到97.72%,而Q30為90.63%。白細(xì)胞和紅細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組GO注釋后,發(fā)現(xiàn)兩種樣本的注釋結(jié)果相似程度較高。結(jié)果顯示,注釋到“molecular function”的次數(shù)最多(10,198,57.50%),其次是“bilogical process”和“cellular component”。將紅細(xì)胞和白細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組預(yù)測(cè)基因比對(duì)到KOG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,共有14260個(gè)預(yù)測(cè)蛋白成功注釋上KOG數(shù)據(jù)庫(kù)。19,762個(gè)基因成功注釋到COG數(shù)據(jù)庫(kù)。聚類到“signal transduction mechanisms”中的基因數(shù)量與注釋到其他條目的基因數(shù)量相比最多,共2427個(gè);接著是“general function prediction only”和“transcription”,分別注釋了1184和1036個(gè)基因;聚類到“defense mechanisms”的基因共有134個(gè)。將兩種細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行差異分析后結(jié)果顯示,共有20,876個(gè)基因檢測(cè)到表達(dá)。其中,兩種細(xì)胞中共同表達(dá)的基因有16,231個(gè)。在白細(xì)胞中特異表達(dá)的基因共有3,628個(gè),而在紅細(xì)胞中特異性表達(dá)的有1,017個(gè)基因。我們通過(guò)對(duì)兩種細(xì)胞中共同表達(dá)的基因進(jìn)行顯著性差異分析,發(fā)現(xiàn)其中有3,251個(gè)基因存在顯著差異。其中,707(21.75%)個(gè)基因在紅細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于在白細(xì)胞中的表達(dá)量,而2544(78.25%)個(gè)基因在紅細(xì)胞中的表達(dá)量顯著低于在白細(xì)胞中的表達(dá)量。對(duì)羅非魚轉(zhuǎn)錄組的研究發(fā)現(xiàn),羅非魚紅細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中含有大量免疫基因,包括模式識(shí)別受體、補(bǔ)體成分、炎癥因子和受體、抗原提呈和處理分子、接頭、效應(yīng)因子和信號(hào)傳導(dǎo)因子等幾大類。同時(shí),羅非魚紅細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的KEGG注釋結(jié)果表明,羅非魚紅細(xì)胞包含了多種先天性免疫系統(tǒng)相關(guān)的信號(hào)通路,如Toll樣受體信號(hào)通路、RIG-I樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路等。使用qPCR試驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)poly(I:C)刺激24小時(shí)后的羅非魚紅細(xì)胞和白細(xì)胞。結(jié)果顯示,白細(xì)胞免疫基因的擴(kuò)增結(jié)果表明,7種免疫基因表達(dá)量均在poly(I:C)注射處理后出現(xiàn)上調(diào)。其中irf3和irf9為顯著上調(diào),而irf1、irf2、irf4、irf5和tlr3為極顯著上調(diào)。對(duì)于羅非魚紅細(xì)胞,有5種免疫基因在處理后出現(xiàn)上調(diào)。其中,irf1和irf9為顯著上調(diào),而irf3、irf4和tlr3為極顯著上調(diào)。而irf2未出現(xiàn)顯著性變化。而irf5刺激后的表達(dá)量低于刺激前的表達(dá)量,但沒(méi)有顯著性。尼羅羅非魚干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF1)的表達(dá)量在IRF家族中最高,實(shí)驗(yàn)克隆了尼羅羅非魚IRF1基因cDNA全長(zhǎng),與其它脊椎動(dòng)物IRF1基因進(jìn)行比對(duì),構(gòu)建IRF家族系統(tǒng)進(jìn)化樹。然后使用polyI:C對(duì)尼羅羅非魚進(jìn)行體內(nèi)注射誘導(dǎo)抗病毒免疫反應(yīng),利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)處理組和對(duì)照組中尼羅羅非魚各組織IRF1基因的表達(dá)差異。最后構(gòu)建尼羅羅非魚IRF1基因真核表達(dá)載體,對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn),尼羅羅非魚IRF1有888bp的開放讀碼框,能把編碼295個(gè)氨基酸的蛋白序列。該蛋白N端高度保守,并含有6個(gè)保守的色氨酸,具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。對(duì)蛋白相似率的計(jì)算發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚與斑馬魚IRF1相似度為52.1%。而與大鼠IRF1的相似率最低,為36.2%。IRF家族成員蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,IRF家族共分為四個(gè)亞群。將pCMV3-FLAG-IRF1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中后,對(duì)IRF1基因進(jìn)行核定位發(fā)現(xiàn),尼羅羅非魚IRF1主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞核中有少量分布。定量PCR檢測(cè)到各個(gè)組織中IRF1在不同暴露時(shí)間下的表達(dá)水平有顯著差異。
【圖文】：

果 羅非魚血細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察染色結(jié)束后，使用顯微鏡觀察染色結(jié)果。如圖 1-1 所示，通過(guò)對(duì)羅非魚外周循統(tǒng)中全血及分離后的紅、白細(xì)胞分別進(jìn)行吉姆薩-瑞氏染色，觀察到羅非魚全視野下紅細(xì)胞占多數(shù)，而白細(xì)胞數(shù)量較少，且形狀不規(guī)則(1-1A)。羅非魚紅細(xì)數(shù)為橢圓形，胞質(zhì)染色不明顯，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，，呈圓形或橢圓形(1-1B)后的白細(xì)胞形態(tài)不一，由多種白細(xì)胞構(gòu)成。其中，嗜中性粒細(xì)胞的細(xì)胞核成狀，較小，位于細(xì)胞的一側(cè)。淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核較大，核質(zhì)比較高(1-1C)。通算顯微鏡視野下各種細(xì)胞的數(shù)量以確定分離后紅細(xì)胞和白細(xì)胞的純度，我們使用細(xì)胞分離液的分離效果較好，紅細(xì)胞的純度高于 99%，而白細(xì)胞的純度 90-95%。

上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文2.2 羅非魚紅細(xì)胞細(xì)胞器熒光染色結(jié)果觀察熒光染色結(jié)束后羅非魚紅細(xì)胞細(xì)胞器的染色情況見圖 1-2。如圖 1-2 所示，利用純化后的羅非魚紅細(xì)胞結(jié)合細(xì)胞器熒光染色試劑對(duì)紅細(xì)胞中的細(xì)胞器進(jìn)行染色，結(jié)果顯示，染色后的紅細(xì)胞在熒光顯微鏡的觀察下顯示有綠色熒光及紅色熒光。熒光染色結(jié)果表明，在羅非魚紅細(xì)胞細(xì)中，不僅存在細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中還存在一定的細(xì)胞器，如溶酶體和線粒體等 (圖 1-2)。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S917.4

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 張冬杰;;維生素C對(duì)視黃酸受體β基因的調(diào)控[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年03期

2 齊幫若;李慶章;;光照對(duì)小鼠下丘腦視上核及乳腺組織鐘基因Clock表達(dá)的影響[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2012年09期

3 趙蘭;徐鵬;孫效文;;碳酸鹽堿度脅迫下鯉魚氨排泄相關(guān)基因的差異表達(dá)[J];生物技術(shù)通報(bào);2013年04期

4 蔣瑤;戚曉利;唐芳;趙樹堂;陳軍;盧孟柱;;利用基因芯片篩選影響莖分化的相關(guān)基因[J];林業(yè)科學(xué);2012年11期

5 魏平;張軍科;;低濃度SA誘導(dǎo)桃葉片PGIP基因的表達(dá)變化[J];北方園藝;2011年17期

6 王小海;楊力俠;吳勇延;杜娟;唐波;郭澤坤;;小鼠Gli-similar-1(Glis1)基因新轉(zhuǎn)錄本功能分析[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2012年07期

7 ;[J];;年期

相關(guān)會(huì)議論文 前8條

1 李勇;趙如冰;陳星;;同型半胱氨酸誘發(fā)體外培養(yǎng)大鼠胚胎基因表達(dá)變化的基因芯片研究[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)第三屆全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文（摘要）集[C];2001年

2 張家平;黃躍生;楊宗城;;燒傷早期心肌組織幾種炎癥相關(guān)基因表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究[A];全國(guó)燒傷創(chuàng)面處理、感染專題研討會(huì)論文匯編[C];2004年

3 伍亞民;劉媛;王正國(guó);;Hes基因在神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育中的作用[A];“基因、進(jìn)化與生理功能多樣性”海內(nèi)外學(xué)術(shù)研討會(huì)暨中國(guó)生理學(xué)會(huì)第七屆比較生理學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2009年

4 馬慧敏;呂曉迎;陸慧琴;;基于GenMAPP的Ni~(2+)表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)差異表達(dá)基因的功能路徑分析[A];中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程進(jìn)展——2007中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程聯(lián)合學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2007年

5 張繼紅;梁力建;黃潔夫;;Fas基因表達(dá)變化在Genistein抑制肝癌增長(zhǎng)中的作用[A];第十二屆全國(guó)肝癌學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

6 李玲;鄔利婭-伊明;趙蕾;于永生;李冬潔;蘇定馮;;RAS各組份的基因在SHR心、腎、主動(dòng)脈中的表達(dá)及其意義[A];第九屆全國(guó)心血管藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

7 朱瑩瑩;倪道鳳;許彩民;;AD模型大鼠嗅球組織基因表達(dá)變化的篩選及目的基因的驗(yàn)證[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國(guó)耳鼻咽喉-頭頸外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編（下）[C];2007年

8 黃文芳;楊永長(zhǎng);劉華;曾婭莉;周定安;胥國(guó)強(qiáng);劉文;;基因芯片技術(shù)篩選辛伐他汀作用K562細(xì)胞的差異表達(dá)基因[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議資料匯編[C];2008年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前3條

1 衣曉峰;哈醫(yī)大一院系列研究阿爾茨海默病關(guān)聯(lián)基因[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2007年

2 楊駿;肥胖可能與炎癥基因有關(guān)[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2004年

3 通訊員 蔡心軼 記者 程守勤;哪些人體基因易受PM2.5影響[N];健康報(bào);2014年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 陳紅艷;刺槐中參與共生固氮的結(jié)瘤相關(guān)基因的分離鑒定和功能分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

2 董燕妮;擬南芥和油菜磷脂酶基因pPLAIIIδ的功能分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 任艷萍;轉(zhuǎn)PRL基因小鼠模型的構(gòu)建與Stat5a的乳腺發(fā)育調(diào)控機(jī)理研究[D];廣西大學(xué);2014年

4 施堯;枯草桿菌蛋白酶基因6在須癬毛癬菌致病性中的功能研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 吳幼容;觀音竹鹽脅迫的生理響應(yīng)與基因表達(dá)分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2012年

6 張靜思;基于基因芯片和生物學(xué)分析技術(shù)對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓急性腎臟損傷相關(guān)基因的研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2015年

7 訾臣;miRNAs對(duì)斷奶仔豬大腸桿菌抗性的調(diào)控作用及機(jī)制分析[D];揚(yáng)州大學(xué);2015年

8 谷溪;miR-124a促進(jìn)神經(jīng)突起生長(zhǎng)靶基因及其作用機(jī)制的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

9 張亮;擬南芥Athspr新基因的抗鹽性及表達(dá)調(diào)控研究[D];蘭州大學(xué);2014年

10 王海飛;豬外周血單核細(xì)胞抗病毒反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組及全基因組DNA甲基化調(diào)控研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李紫薇;蒺藜苜蓿E2F/DP基因鑒定及鹽脅迫表達(dá)分析[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

2 栗振義;紫花苜蓿熱激蛋白基因MsHSP70的克隆及功能分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

3 陳凱麗;綿羊SPLUNC1基因的克隆、表達(dá)及活性檢測(cè)[D];石河子大學(xué);2015年

4 翟曼君;雞與鵪鶉屬間雜交種胚胎早期死亡相關(guān)基因的功能研究[D];石河子大學(xué);2015年

5 任曉宇;飛蝗CYP4和CYP303A1基因的分子特性和功能研究[D];山西大學(xué);2014年

6 劉恒生;豬LMNA基因?qū)τ诩∪夂椭景l(fā)育及分化的調(diào)控研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 謝向;小麥組蛋白去乙酰化酶基因TaHD2C功能研究[D];山東大學(xué);2015年

8 劉明麗;斑馬魚低溫響應(yīng)基因順式調(diào)控元件的鑒定及鱗頭犬牙南極魚ATP6V0C基因在HeLa細(xì)胞中抗寒研究[D];上海海洋大學(xué);2015年

9 張偉;轉(zhuǎn)錄組篩選調(diào)控脂肪儲(chǔ)存基因[D];中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué);2015年

10 孔曄;馬鈴薯甲蟲4個(gè)細(xì)胞色素P450氧化酶基因的分子克隆及功能驗(yàn)證[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2611013