發(fā)布時間：2020-03-31 01:31

【摘要】：羅非魚是我國重要的養(yǎng)殖魚類,其養(yǎng)殖產(chǎn)量占世界總養(yǎng)殖量一半以上。無乳鏈球菌(Group B streptococcus,GBS)是危害羅非魚養(yǎng)殖的重要細菌性病原。羅非魚無乳鏈球菌病是我國亟需控制和凈化的水生動物三類疾病。目前,羅非魚無乳鏈球菌病的研究已得到了足夠的重視與支持,但研究熱點集中在應用研究,基礎研究相對薄弱。脾臟是魚類重要的免疫造血器官,也是GBS主要侵襲的部位。因此,本論文對無乳鏈球菌感染后羅非魚脾臟開展了系統(tǒng)的病理學研究,以期豐富該病的基礎研究,為后續(xù)的應用研究提供奠定基礎。為明確羅非魚脾臟的正常結(jié)構(gòu)和功能,本研究首先對正常的脾臟進行了組織學觀察和血脾屏障定位;接著,對GBS感染后的脾臟進行了動態(tài)病理學觀察,建立了病理評分體系,并對感染進行了分期,為后續(xù)深入研究脾臟的病理學提供了取樣指導;通過超微病理學觀察,對各病理分期的脾臟與細菌的互作關系進行了分析,揭示了脾臟的病理損傷機制和GBS的致病機制;在此基礎上,對4種不同病理分期的脾臟進行了轉(zhuǎn)錄組測序,對脾臟的各病理分期的信號通路、關鍵基因進行了分析,為研究感染后脾臟的分子病理學提供了理論依據(jù);并進一步,對各病理分期脾臟的免疫功能進行了探討,為揭示脾臟免疫功能失敗的分子機制提供了新思路。具體實驗內(nèi)容如下:1.尼羅羅非魚脾臟的正常結(jié)構(gòu)研究通過大體解剖、腐蝕,結(jié)合光學和電子顯微技術對尼羅羅非魚脾臟進行了觀察。結(jié)果顯示:尼羅羅非魚脾臟為獨立的臟器,位于前腸和胃之間。被膜薄、小梁不發(fā)達,紅髓和白髓分界不清。白髓內(nèi)橢球體清晰、具有少量黑色素巨噬細胞中心和淋巴細胞小泡。橢球體由立方狀內(nèi)皮細胞、網(wǎng)狀纖維和吞噬細胞組成。脾索由網(wǎng)狀細胞交織成網(wǎng),紅細胞變形通過網(wǎng)眼;網(wǎng)狀細胞外周有淋巴細胞和單核-巨噬細胞附著。網(wǎng)狀纖維主要分布在紅髓的脾索和血管周圍,而膠原纖維主要分布在脾索和脾動脈周圍。結(jié)合腐蝕后脾臟的血管分布和脾臟的顯微結(jié)構(gòu),可將脾臟分為3區(qū):內(nèi)區(qū)、中區(qū)和外區(qū)。臺盼藍活體染色法定位羅非魚血脾屏障,結(jié)果顯示:腹腔注射后,臺盼藍主要聚集在橢球體內(nèi)皮細胞內(nèi);尾靜脈注射后,臺盼藍主要附著于橢球體的網(wǎng)狀纖維上。結(jié)果表明:羅非魚血脾屏障位于橢球體,由橢球體內(nèi)皮細胞和網(wǎng)狀纖維組成。2.無乳鏈球菌感染后尼羅羅非魚脾臟的動態(tài)病理研究使用劑量為1×107cfuGBS攻毒羅非魚,于注射后0-72h,每4h采集脾臟,記錄脾臟的大體、組織病理變化和細菌的動態(tài)分布。結(jié)果顯示:大體病理變化主要體現(xiàn)在脾體指數(shù)和被膜。表現(xiàn)為:脾體指數(shù)在攻毒后4-8 h顯著降低,12-20 h顯著增加,24-36 h恢復正常,并在40-72 h極顯著增加;被膜在40-72 h可見白色纖維素膜覆蓋。主要組織病理變化為:攻毒后4-8h,橢球體聚集、脾血竇空虛、淋巴細胞和MMCs增多;12-20 h,橢球體內(nèi)皮細胞空泡變性、幼紅細胞增多、淋巴細胞和MMCs減少;24-32h,橢球體周圍網(wǎng)狀細胞增生,MMCs和淋巴細胞大量減少;36-40h,脾臟內(nèi)形成增生性結(jié)節(jié);44-72 h,增生性結(jié)節(jié)發(fā)展為滲出性或壞死性結(jié)節(jié)。被膜和被膜下組織在44-72 h出現(xiàn)帶狀壞死,與正常組織交界處形成明顯的反應帶。血管和纖維在攻毒后4-8 h,血管內(nèi)壁受損,網(wǎng)狀纖維收縮、聚集;12-44 h,網(wǎng)狀纖維逐漸斷裂、溶解;48-72 h,網(wǎng)狀纖維幾乎消失,膠原纖維逐漸溶解。細菌在攻毒后20 h在橢球體內(nèi)皮細胞中出現(xiàn),24-48 h數(shù)量增多,但始終位于橢球體內(nèi)皮細胞內(nèi);52-72 h后,大多數(shù)脾臟的細菌數(shù)量明顯減少。結(jié)合典型病理變化和GBS含量,可將脾臟分為4期,各期的特征性病理變化為:早期,橢球體聚集;反應期,幼紅細胞增多;緩滯期,增生性結(jié)節(jié);危亡期,壞死性結(jié)節(jié)形成。3.無乳鏈球菌劑量對尼羅羅非魚脾臟感染分期的影響使用不同劑量GBS(A-1×106cfu、B-1×107cfu、C-1×108cfu)攻毒羅非魚,分別于注射后4 h,8 h,24 h,72 h,以及A組的7 d和14 d采集脾臟,記錄脾臟的大體、組織病理變化和細菌的含量,并運用評分體系進行感染分期。結(jié)果顯示:A、B、C組魚體出現(xiàn)死亡時間分別為10 d、40 h和16 h。病理分期為:A組4-8 h為早期,24-72 h為反應期和緩滯期,7 d為危亡期;C組4-8 h為早期和反應期,24-72 h為緩滯期和危亡期,同時在8-24 h新增了急性壞死期。B組病理分期同第三章。構(gòu)建sip-qPCR方法,對各感染時間點的GBS進行定量分析,結(jié)果顯示:A組0-7 d均無GBS檢出;B組,8 h開始檢測到少量GBS,24 h GBS數(shù)量最多,72 h GBS減少;C組與B組GBS數(shù)量變化趨勢一致,但C組GBS含量高于B組。結(jié)果表明:攻毒濃度可影響脾臟的病理分期和脾臟的細菌含載量;在1.0×108cfu攻毒劑量時,出現(xiàn)了第5種病理分期,即急性壞死期。4.無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚脾臟的超微病理學觀察透射電鏡技術觀察5種病理分期中脾臟與GBS的互作關系,結(jié)果顯示:早期,脾臟橢球體毛細血管收縮,單核細胞貼壁并穿透血管壁進入脾臟實質(zhì);脾細胞損傷不明顯;細菌數(shù)量少。反應期,吞噬細胞內(nèi)初級/次級溶酶體增加,胞漿內(nèi)可見大量單層、雙層甚至多層膜包裹的細菌和細菌殘屑;部分吞噬細胞和淋巴細胞的線粒體腫脹和核膜擴張;少數(shù)GBS在胞內(nèi)存活并繁殖。緩滯期,細胞內(nèi)細菌數(shù)量明顯減少,橢球體周圍網(wǎng)狀細胞大量增生。危亡期橢球體毛細血管內(nèi)皮細胞壞死,脫落堵塞血管腔;細菌數(shù)量少。急性壞死期,橢球體內(nèi)皮細胞內(nèi)滿載細菌;紅細胞參與吞噬殺滅細菌。整個感染過程中,存活細菌表面具有豐富的莢膜圍繞,而死亡細菌表面未觀察到莢膜。掃描電鏡觀察急性壞死期脾細胞的形貌變化,結(jié)果顯示:GBS感染后脾臟內(nèi)紅細胞鼓脹變形,并在脾髓內(nèi)大量淤滯;GBS附著在網(wǎng)狀纖維上。結(jié)果表明:脾臟的橢球體內(nèi)皮細胞、紅細胞和吞噬細胞可吞噬和清除GBS;而GBS可損傷細胞,并產(chǎn)生莢膜促進胞內(nèi)存活。5.無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚脾臟的轉(zhuǎn)錄組分析Illumina HiSeqTM 2500高通量測序技術檢測脾臟反應期(Lym)、急性壞死期(Nec)、緩滯期(Hem)、危亡期(Hyp)的mRNA變化,結(jié)果顯示:GBS感染后,共獲得感染差異基因6295個,其中共有差異基因364個,特有差異基因Lym 834個,Nec 1578個,Hem 232 個,Hyp 568 個。對感染差異基因、共有差異基因和特有差異基因進行GO富集性分析,結(jié)果顯示:感染差異基因和共有差異基因分別在免疫反應和抗原識別與遞呈反應中顯著富集;Lym、Nec、Hem特有差異基因分別顯著富集于免疫和抗炎反應、分解代謝過程、細胞分裂增殖反應中;Hyp特有差異基因在分子功能和生物學過程中富集均不顯著。對感染差異基因、共有差異基因和各分期的特有差異基因進行KEGG信號通路富集性分析,結(jié)果顯示:感染差異基因和共有差異基因分別顯著富集于免疫系統(tǒng)通路和信號傳導通路中;Lym、Nec、Hem特有差異表達基因分別主要富集于細胞因子-細胞因子信號通路和TNF信號通路、脂肪酸降解信號通路、細胞周期通路中;Hyp特有差異基因中無顯著富集信號通路。篩選共有差異基因和特有差異基因中,FPKM100的參與免疫、炎癥和造血的基因,結(jié)果顯示:共有差異基因中組織蛋白酶L差異顯著;Lym中CXCL10和IV型膠原蛋白酶差異顯著;Nec中IL-8和補體C1q子亞基B差異顯著;Hem中MHCI和DDIT4差異顯著;Hyp中MHCⅡγ、組織蛋白酶D、CD209、血紅蛋白α和甘露糖凝集素差異顯著。結(jié)果表明:Lym差異基因主要富集于免疫反應,可能與淋巴細胞增多有關;Hem中細胞周期通路顯著變化,可能與網(wǎng)狀細胞增生有關;Nec中脂肪酸降解信號通路基因顯著,可能與細胞的壞死有關。6.無乳鏈球菌對尼羅羅非魚脾臟免疫功能的影響RNA-Seq分析尼羅羅非魚脾臟的PRRS(TLRs、NLRs、RLR、CLRs),結(jié)果顯示:GBS后,TLRs表達量明顯高于較其他PRRS,其中TLR5在Nec、Lym和Hem中顯著上調(diào),TLR13在Nec、Lym中顯著下調(diào),而TLR1在Nec、Lym和Hyp中顯著下調(diào)。將TLRs序列與NCBI和UniPort中報道的其他魚類和人類TLRs進行比對,并采用Mega 4.1軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示:羅非魚的TLR5與人、斑馬魚等的TLR5聚為一簇。對TLR5介導的下游因子IL-1β和IL-8的檢測顯示:IL-1β、IL-8在Nec中顯著高于其他各組。推測TLR5介導促炎因子IL-1β和IL-8的大量表達,可能是導致脾臟過度炎癥,出現(xiàn)脾臟急性壞死的重要因素。分析免疫系統(tǒng)相關因子 C3、MHCⅡα、CSF1R、TCRα、TCRβ,MHCI、RAG1、IgM并對變化顯著的基因進行qPT-PCR驗證。結(jié)果顯示:C3、TCRα、TCRβ、CSF1R、RAG1、MHCI在羅非魚感染前后表達量變化不顯著;MHC Ⅱ在Hyp、Hem中顯著下調(diào);而IgM在GBS感染后顯著上調(diào)。提示,脾臟的體液免疫是GBS感染后的主要免疫應答系統(tǒng),而IgM是重要的免疫分子。進一步對羅非魚sIgM進行原核克隆表達,制備兔抗IgM-IgG抗體,運用ELISA和免疫熒光分別檢測感染后血清IgM效價和脾臟中IgM分布。結(jié)果顯示:原核sIgM蛋白在BL21-PET32-sIgM中成功得到了表達。運用sIgM免疫家兔獲得了親和力高、特異性強的sIgM-IgG。ELISA檢測血清IgM顯示感染后IgM均未升高,且免疫熒光檢測的脾臟中IgM的免疫熒光信號也未見明顯變化。表明,GBS抑制了 IgM的轉(zhuǎn)錄后翻譯。綜上結(jié)果表明,GBS感染尼羅羅非魚后,脾臟的結(jié)構(gòu)和功能受到了明顯的損傷。其中,增生可能是導致魚體慢性死亡的重要原因;而過度的炎癥反應可能是導致魚體急性死亡的重要原因。
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（３）邋ＲＩＧ－Ｉ邋樣受體（ＲＩＧ－Ｉ邋ｌｉｋｅ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，，ＲＬＲｓ）逡逑ＲＬＲｓ是具有抗病毒功能，能夠識別細胞質(zhì)中病毒的ＲＮＡ，誘導干擾素產(chǎn)生的一類逡逑模式識別受體，包含３個成員（圖１－２）：視黃酸誘導基因Ｉ邋（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ邋ａｃｉｄ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ邋ｇｅｎｅ邋１，逡逑ＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８）、黑色素瘤分化相關基因邋５邋（Ｍｅｌａｎｏｍａ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｇｅｎｅ邋５，逡逑ＭＤＡ５／ＩＦＩＨ１）和邋ＬＧＰ２（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ邋ｏｆ邋ｇｅｎｅｔｉｃｓ邋ａｎｄ邋ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ邋２／ＤＨＸ５８）。其中邋ＲＩＧ－Ｉ邋和逡逑ＭＤＡ５通過不同的分子機制，識別不同的病毒，并通過線粒體抗病毒信號通路（ＭＡＶＳ，逡逑８逡逑

￣ＮＡＣＨＴ邋｜邐逡逑圖１－１邋ＮＯＤ樣受體的分類與結(jié)構(gòu)［８９］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＮＯＤ－ｌｉｋｅ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ＾８９＇逡逑相比哺乳動物的ＮＬＲｓ，魚類具有更加廣泛的ＮＬＲｓ家族。在硬骨魚類中還發(fā)現(xiàn)了逡逑一類魚類特有的含ＰＹＤ結(jié)構(gòu)域的ＮＬＲ亞家族成員。該蛋白在ＮＬＲＰ的Ｃ端多出一個逡逑Ｂ３０．２區(qū)，即ＰＲＤ－ＮＡＣＨＴ－ＬＲＲ－Ｂ３０．２。分析該蛋白結(jié)構(gòu)顯示，Ｂ３０．２替代了邋ＬＲＲ的作逡逑用，成為病原識別位點［９４］。目前，在魚類中己發(fā)現(xiàn)有８種保守的ＮＬＲｓ蛋白，包括轉(zhuǎn)錄逡逑調(diào)節(jié)子ＣＩＩＴＡ和ＮＬＲ５，炎性小體和Ｎｏｄ小體蛋白ＮＯＤＩ，邋Ｎ０Ｄ２，ＮＯＤ３／ＮｌｒＣ３，逡逑Ｎ０Ｄ９／ＮＬＲＸ１，以及目前功能尚不清楚的ＮａｃｈｔＰｌ／ＮＷＤｌ和ＡＰＡＦ１１９５１。自２００８年，在逡逑斑馬魚上首次發(fā)現(xiàn)哺乳動物ＮＬＲｓ同源物以來，己在斑馬魚上發(fā)現(xiàn)約４００種ＮＬＲｓ蛋白逡逑［９６］。在鯰魚中已發(fā)現(xiàn)了邋５邋種邋ＮＬＲ：邋ＮＯＤＩ，邋ＮＯＤ２，邋ＮＬＲＣ３，邋ＮＬＲＣ５邋和邋ＮＬＲＸ１【９７］。草逡逑魚中發(fā)現(xiàn)了邋ＮＯＤ１和ＮＯＤ２［９８］；虹鱒具有２個ＮＯＤ２的剪接變異體［９９］；牙庝具有魚類逡逑特有的ＮＬＲＣｎ（Ｘ）］。南亞野鯪中發(fā)現(xiàn)了邋ＮＯＤ１類似物［１Ｑ１］；黑石斑魚上發(fā)現(xiàn)了邋ＮＬＲＣ５。逡逑（３）邋ＲＩＧ－Ｉ邋樣受體（ＲＩＧ－Ｉ邋ｌｉｋｅ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S943


本文編號：2608359