發(fā)布時(shí)間：2025-03-14 23:06

　　水稻有著悠久的種植歷史,也是目前世界上食用人數(shù)最多的糧食作物之一。隨著人口的增加,如何保障糧食穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)關(guān)系到國計(jì)民生,因此如何提高水稻的單位面積產(chǎn)量一直是水稻遺傳學(xué)家和育種家致力解決的重大課題。隨著基因組測序的完成和功能基因組學(xué)研究的廣泛開展,越來越多的分子生物學(xué)手段被用于遺傳育種領(lǐng)域。水稻遺傳資源的挖掘一直是遺傳和育種工作者關(guān)注的焦點(diǎn)問題。為了更加高效快速準(zhǔn)確地創(chuàng)制水稻遺傳資源,新的突變體創(chuàng)制方法不斷被用于水稻。其中最近幾年興起的CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù)成功地在多種生物中實(shí)現(xiàn)了高效快速的基因打靶。本研究開發(fā)了一套適用于水稻的CRISPR/CAS9基因編輯技術(shù),并且在此基礎(chǔ)上通過不同的方法擴(kuò)展了該技術(shù)在水稻中的廣適用性,滿足了水稻中不同類型基因編輯的需求。小花作為承載水稻種子的核心器官,其發(fā)育的好壞直接決定了水稻產(chǎn)量的高低,因此小花的發(fā)育一直是水稻研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。生長素在植物的各個(gè)生長發(fā)育時(shí)期均有重要的作用,但是目前生長素對小花發(fā)育的影響卻知之甚少。PID(PINOID)基因在擬南芥中主要調(diào)控生長素的運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)。本研究以水稻中OsPIDa為研究對象,通過序列分析,基因克隆,...

【文章頁數(shù)】：226 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 水稻CRISPR/CAS9技術(shù)構(gòu)建
    1 前言
        1.1 研究問題的由來
        1.2 植物突變體構(gòu)建方法的研究進(jìn)展
            1.2.1 隨機(jī)誘變
                1.2.1.1 物理誘變
                1.2.1.2 化學(xué)誘變
                1.2.1.3 DNA標(biāo)簽插入誘變
            1.2.2 定點(diǎn)誘變
                1.2.2.1 ZFN的原理及構(gòu)建方法
                1.2.2.2 TALEN原理及構(gòu)建方法
                1.2.2.3 CRISPR/CAS原理及構(gòu)建方法
        1.3 CRISPR/CAS9技術(shù)目前的研究進(jìn)展
            1.3.1 提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的生產(chǎn)力
                1.3.1.1 針對CAS9進(jìn)行密碼子的優(yōu)化
                1.3.1.2 提高CRISPR/CAS9基因編輯特異性和效率
                1.3.1.3 提高CRISPR/CAS9基因編輯后突變的遺傳穩(wěn)定性
                1.3.1.4 使用CRISPR/CAS9進(jìn)行多基因編輯
            1.3.2 提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的質(zhì)量控制
                1.3.2.1 CRISPR/Cas9基因組編輯突變的檢測
                1.3.2.2 篩選穩(wěn)定遺傳株系
                1.3.2.3 時(shí)空特異性基因編輯
                1.3.2.4 提高CRISPR/CAS9基因編輯系統(tǒng)的精確性
                1.3.2.5 獲取不帶有轉(zhuǎn)基因片段的突變株系
        1.4 研究的目的和意義
    2 材料和方法
        2.1 水稻誘導(dǎo)型CRISPR/CAS9骨架載體的構(gòu)建
        2.2 水稻高效CRISPR/CAS9基因編輯骨架載體的構(gòu)建
        2.3 構(gòu)建單sgRNA元件的CRISPR/CAS9載體
        2.4 通過兩步酶切連接構(gòu)建雙sgRNA元件的CRISPR/CAS9載體
        2.5 通過一步酶切連接構(gòu)建雙sgRNA元件的CRISPR/CAS9載體
        2.6 構(gòu)建雙RGR元件的CRISPR/CAS9載體
        2.7 將雙RGR元件和普通sgRNA轉(zhuǎn)錄單元組合
        2.8 構(gòu)建PolⅡ型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)雙RGR元件的載體
        2.9 轉(zhuǎn)基因陽性苗的檢測
        2.10 CRISPR/CAS9突變形式的檢測與分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 水稻誘導(dǎo)型CRISPR/CAS9基因編輯效果檢測
        3.2 利用CRISPR/CAS9建立水稻中高效基因編輯系統(tǒng)
        3.3 一種sgRNA靶向多個(gè)位點(diǎn)的基因編輯
        3.4 使用多sgRNA轉(zhuǎn)錄盒進(jìn)行多位點(diǎn)基因編輯
            3.4.1 使用連續(xù)酶切的方法構(gòu)建多sgRNA轉(zhuǎn)錄盒
            3.4.2 使用一步酶切連接法構(gòu)建多sgRNA轉(zhuǎn)錄盒
        3.5 利用RGR技術(shù)進(jìn)行多位點(diǎn)基因編輯
        3.6 將已構(gòu)建好的CRISPR載體與RGR元件組合應(yīng)用于多基因編輯
        3.7 水稻中使用PolⅡ類型的啟動(dòng)子啟動(dòng)sgRNA的效果
    4 討論
        4.1 CRISPR/CAS9基因編輯材料的遺傳穩(wěn)定性
        4.2 誘導(dǎo)型CRISPR/CAS9基因編輯的優(yōu)點(diǎn)
        4.3 快速獲取可以穩(wěn)定遺傳的突變體
        4.4 靶序列設(shè)計(jì)的注意事項(xiàng)
        4.5 基因編輯材料的檢測
        4.6 多位點(diǎn)基因編輯的注意事項(xiàng)
        4.7 RGR技術(shù)的應(yīng)用范圍
        4.8 展望
            4.8.1 利用CRISPR/CAS9構(gòu)建水稻的突變體庫
            4.8.2 使用CRISPR/CAS9技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)插入或替換
            4.8.3 使用CRISPR/CAS9技術(shù)進(jìn)行更加精確的點(diǎn)突變
            4.8.4 利用CRISPR技術(shù)進(jìn)行體外DNA編輯和克隆
            4.8.5 CRISPR/CAS9技術(shù)對水稻育種的作用
第二章 花發(fā)育相關(guān)基因OsPIDa的功能研究
    1 前言
        1.1 研究問題的由來
        1.2 生長素相關(guān)基因的研究進(jìn)展
            1.2.1 生長素合成
            1.2.2 生長素運(yùn)輸
            1.2.3 生長素信號(hào)傳導(dǎo)
        1.3 生長素對水稻生長發(fā)育的影響
            1.3.1 生長素調(diào)節(jié)水稻株型
            1.3.2 生長素調(diào)控水稻花序發(fā)育
            1.3.3 生長素影響水稻種子發(fā)育
            1.3.4 生長素控制水稻根系的發(fā)育
            1.3.5 生長素參與水稻脅迫反應(yīng)
        1.4 研究的目的和意義
    2 材料和方法
        2.1 水稻材料及田間種植
        2.2 菌株和載體
        2.3 水稻T-DNA突變體的篩選
        2.4 水稻TILLING突變體的篩選
        2.5 水稻穗部性狀的考察
        2.6 水稻不同時(shí)期幼穗取樣
        2.7 水稻花粉粒育性的初步考察
        2.8 各種載體的構(gòu)建
            2.8.1 過量表達(dá)載體與互補(bǔ)載體的構(gòu)建
            2.8.2 亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建
            2.8.3 CRISPR/CAS9載體的構(gòu)建
        2.9 水稻的基因型檢測
            2.9.1 T-DNA插入突變體的基因型檢測
            2.9.2 TILLING突變體的基因型檢測
            2.9.3 CRISPR/CAS9突變體的基因型檢測
        2.10 擬南芥原生質(zhì)體的亞細(xì)胞定位
        2.11 多序列比對與進(jìn)化樹分析
        2.12 水稻表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 PID基因家族的同源比對與進(jìn)化樹分析
        3.2 OsPID基因家族T-DNA插入突變體的篩選與鑒定
        3.3 通過T-DNA插入突變體構(gòu)建OsPID家族基因的雙突變體
        3.4 OsPID家族相關(guān)基因的TILLING突變體的篩選與鑒定
        3.5 ospida-1,ospida-2突變體導(dǎo)致水稻結(jié)實(shí)率下降
        3.6 ospida-1,ospida-2的遺傳分析
            3.6.1 ospida-1的基因型檢測與遺傳分析
            3.6.2 ospida-2的基因型檢測與遺傳分析
        3.7 ospida突變體對穗發(fā)育的影響
            3.7.1 ospida突變體對穗部農(nóng)藝性狀的影響
            3.7.2 ospida小花整體出現(xiàn)畸變
            3.7.3 ospida-1的柱頭嚴(yán)重退化
            3.7.4 ospida-1雄蕊發(fā)生融合,花粉粒發(fā)育不良
            3.7.5 ospida-1發(fā)生變異起始于枝梗原基發(fā)育之后
        3.8 用OsPIDa的基因組序列互補(bǔ)ospida-1突變體
        3.9 OsPIDa過量表達(dá)的效果
        3.10 OsPIDa的表達(dá)譜分析
        3.11 通過CRISPR/CAS9技術(shù)構(gòu)建OsPIDa的突變體
        3.12 OsPIDb的功能分析以及與OsPIDa的遺傳關(guān)系
        3.13 初步分析OsPIDa與幾個(gè)花發(fā)育相關(guān)基因的關(guān)系
        3.14 OsPIDa的亞細(xì)胞定位
    4 討論
        4.1 水稻中生長素相關(guān)基因的鑒定
        4.2 水稻生長素突變體的表型觀察
        4.3 OsPIDa對水稻花發(fā)育的影響和意義
        4.4 OsPIDa在不同植物系統(tǒng)中的異同點(diǎn)
        4.5 OsPID家族中其它基因的功能研究
        4.6 展望
            4.6.1 OsPIDa其他功能推測
            4.6.2 OsPIDa在育種上的作用
參考文獻(xiàn)
附錄1
    本研究所用引物信息
    靶序列信息表
    部分實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)操作程序
        水稻的雜交
        水稻總DNA的抽提
        水稻總RNA的抽提
        水稻的遺傳轉(zhuǎn)化
        水稻RNA反轉(zhuǎn)錄
        熒光實(shí)時(shí)定量PCR
        掃描電鏡制樣與觀察
        石蠟組織切片
附錄Ⅱ 在讀期間研究成果
致謝



本文編號(hào)：4034756