冬蟲夏草[Ophiocordyceps sinensis(Berk.)Sacc]是線蟲草屬真菌寄生在蝙蝠蛾幼蟲上所形成的蟲菌復(fù)合體,作為一種傳統(tǒng)的名貴中藥材在中國已有千年的歷史,具有潤肺、抗心率不齊、調(diào)節(jié)和增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等多種藥理療效。近年來,國內(nèi)外市場對冬蟲夏草的需要量劇增,價(jià)格飆升,造成人為過度采挖,蟲草資源遭到嚴(yán)重破壞,使得人工發(fā)酵冬蟲夏草菌絲體緩解市場需求迫在眉睫。本文圍繞所分離的中國被毛孢菌株在基因組和轉(zhuǎn)錄組測序后所得到的功能基因注釋信息,對參與侵染過程中的幾丁質(zhì)酶功能基因,對蟲草酸、蟲草素和蟲草多糖的生物合成途徑及發(fā)酵調(diào)控展開了詳細(xì)的研究和探討。論文首先研究了從野生冬蟲夏草中分離中國被毛孢菌株的過程。從野生冬蟲夏草的菌核中分離得到了一株與中國被毛孢菌落形態(tài)高度相似的菌株。對此菌株進(jìn)行電鏡觀察、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定、Biolog鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析,結(jié)果表明,所分離菌株的18S rDNA序列與Ophiocordyceps sinensis的18S rDNA序列最高同源性為99%;系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)與Ophiocordyceps sinensis和Hirsutella li...

【文章頁數(shù)】：157 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 引言
    1.2 冬蟲夏草中國被毛孢的研究進(jìn)展
        1.2.1 冬蟲夏草的形態(tài)學(xué)特征
        1.2.2 冬蟲夏草的生活史研究
        1.2.3 冬蟲夏草產(chǎn)業(yè)發(fā)展?fàn)顩r
        1.2.4 冬蟲夏草的無性型研究
    1.3 冬蟲夏草中國被毛孢的主要活性成分及功效
        1.3.1 蟲草酸
        1.3.2 核苷
        1.3.3 蟲草素
        1.3.4 蟲草多糖
        1.3.5 其他活性成分
    1.4 基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序研究
        1.4.1 基因組測序研究
        1.4.2 轉(zhuǎn)錄組測序研究
    1.5 冬蟲夏草深層發(fā)酵及調(diào)控研究
    1.6 冬蟲夏草中國被毛孢的侵染過程研究
        1.6.1 體表附著階段
        1.6.2 體壁穿透階段
        1.6.3 參與侵染機(jī)制的酶
    1.7 本課題的研究目的及主要內(nèi)容
        1.7.1 選題背景及研究目的
        1.7.2 本研究的主要內(nèi)容
第二章 中國被毛孢的分離、鑒定及深層發(fā)酵
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 野生冬蟲夏草的采集
        2.2.2 培養(yǎng)基、試劑及儀器
        2.2.3 分離組織的萌發(fā)
        2.2.4 萌發(fā)組織的純培養(yǎng)
        2.2.5 培養(yǎng)物的菌種鑒定
        2.2.6 18S rDNA序列測定及分析
        2.2.7 中國被毛孢深層發(fā)酵
        2.2.8 蟲草酸的提取及檢測
        2.2.9 核苷類物質(zhì)的提取及檢測
        2.2.10 粗蛋白和總多糖的提取及檢測
        2.2.11 氨基酸的提取及檢測
        2.2.12 粗脂肪及不飽和脂肪酸的提取及檢測
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 微生物形態(tài)學(xué)觀察
        2.3.2 微生物分子生物學(xué)鑒定
        2.3.3 18S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析
        2.3.4 Biolog鑒定
        2.3.5 菌絲體中活性成分含量分析
    2.4 討論
    2.5 本章小結(jié)
第三章 中國被毛孢基因組、轉(zhuǎn)錄組測序及功能基因挖掘
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及培養(yǎng)基
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.4 中國被毛孢基因組的制備
        3.2.5 中國被毛孢基因組測序
        3.2.6 中國被毛孢基因組序列組裝
        3.2.7 中國被毛孢基因組分析
        3.2.8 中國被毛孢總RNA的制備
        3.2.9 中國被毛孢轉(zhuǎn)錄組測序
        3.2.10 中國被毛孢轉(zhuǎn)錄組分析
        3.2.11 中國被毛孢轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)注釋
        3.2.12 中國被毛孢轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析
        3.2.13 幾丁質(zhì)酶功能基因的挖掘及生物信息學(xué)分析
        3.2.14 幾丁質(zhì)酶功能基因的克隆、表達(dá)及蛋白純化
        3.2.15 酶學(xué)性質(zhì)研究
        3.2.16 酶學(xué)穩(wěn)定性、底物特異性及酶學(xué)動力學(xué)研究
        3.2.17 基因差異表達(dá)研究
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 中國被毛孢基因組原始測序數(shù)據(jù)處理
        3.3.2 中國被毛孢基因組測序短讀序列組裝
        3.3.3 中國被毛孢基因組測序ncRNA預(yù)測
        3.3.4 中國被毛孢基因組測序重復(fù)序列分析
        3.3.5 中國被毛孢基因組測序基因預(yù)測
        3.3.6 中國被毛孢基因組測序基因功能注釋
        3.3.7 比較基因組學(xué)
        3.3.8 中國被毛孢總RNA的制備及檢測
        3.3.9 中國被毛孢轉(zhuǎn)錄組測序及組裝
        3.3.10 中國被毛孢轉(zhuǎn)錄組分析
        3.3.11 中國被毛孢轉(zhuǎn)錄組功能基因COG分類
        3.3.12 中國被毛孢轉(zhuǎn)錄組功能基因GO分類
        3.3.13 中國被毛孢轉(zhuǎn)錄組功能基因Pathway注釋
        3.3.14 中國被毛孢轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量分析
        3.3.15 幾丁質(zhì)酶功能基因序列分析
        3.3.16 幾丁質(zhì)酶功能基因的克隆、表達(dá)及蛋白純化
        3.3.17 幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性研究
        3.3.18 幾丁質(zhì)酶最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性研究
        3.3.19 金屬離子對幾丁質(zhì)酶酶活的影響
        3.3.20 底物特異性及酶學(xué)動力學(xué)研究
        3.3.21 幾丁質(zhì)酶功能基因的差異表達(dá)分析
    3.4 討論
    3.5 本章小結(jié)
第四章 蟲草酸和蟲草素生物合成途徑及發(fā)酵調(diào)控
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株與載體
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑及培養(yǎng)基
        4.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.2.4 生物合成途徑的預(yù)測
        4.2.5 生物合成途徑的驗(yàn)證
        4.2.6 熒光定量PCR
        4.2.7 基于生物合成途徑的發(fā)酵調(diào)控
        4.2.8 發(fā)酵調(diào)控后蟲草酸產(chǎn)量的檢測
        4.2.9 發(fā)酵調(diào)控后蟲草素產(chǎn)量的檢測
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 中國被毛孢蟲草酸及蟲草素生物合成途徑分析
        4.3.2 蟲草酸及蟲草素生物合成功能基因的擴(kuò)增
        4.3.3 草酸及蟲草素生物合成功能基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.4 蟲草酸及蟲草素生物合成功能基因的異源表達(dá)
        4.3.5 蟲草酸及蟲草素功能基因的熒光定量PCR
        4.3.6 蟲草酸及蟲草素產(chǎn)量的發(fā)酵調(diào)控
    4.4 討論
    4.5 本章小結(jié)
第五章 基于生物合成途徑分析的蟲草多糖產(chǎn)量提升
    5.1 引言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)菌株及培養(yǎng)基
        5.2.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑
        5.2.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        5.2.4 中國被毛孢的深層發(fā)酵
        5.2.5 菌絲體中蟲草多糖的提取
        5.2.6 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及多糖含量的測定
        5.2.7 蟲草多糖中前體單糖的含量檢測
        5.2.8 甘露糖生物合成途徑預(yù)測及驗(yàn)證
        5.2.9 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)
        5.2.10 甘露糖代謝途徑中功能基因的熒光定量PCR
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 不同金屬離子對蟲草多糖產(chǎn)量的影響
        5.3.2 不同添加劑量及時(shí)間對菌絲體生物量及蟲草多糖產(chǎn)量的影響
        5.3.3 培養(yǎng)基pH、剩余糖分、菌絲體生物量及蟲草多糖產(chǎn)量的動態(tài)監(jiān)測
        5.3.4 發(fā)酵過程中蟲草多糖前體單糖的含量變化
        5.3.5 甘露糖生物合成途徑的構(gòu)建及驗(yàn)證
        5.3.6 甘露糖生物合成功能基因的差異表達(dá)分析
    5.4 討論
    5.5 本章小結(jié)
第六章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 論文創(chuàng)新之處
    6.3 展望
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文
致謝



本文編號：4035102