苦蕎(Fagopyrum tataricum)為蓼科蕎麥屬植物,是一種傳統(tǒng)的藥食兩用小雜糧作物。苦蕎富含蘆丁等黃酮類化合物,具有防止血管硬化、抗衰老和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效,在醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。蘆丁作為苦蕎主要的質(zhì)量性狀,闡明蘆丁合成調(diào)控機(jī)制成為苦蕎研究重點(diǎn),對(duì)提高苦蕎黃酮含量意義重大。黃酮合成途徑是植物苯丙烷代謝途徑的一個(gè)分支,該代謝途徑同時(shí)受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,其中R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是重要一員。本研究以苦蕎品種“西蕎2號(hào)”為材料,克隆獲得轉(zhuǎn)錄因子FtMYB5序列,鑒定其分子特征,分析其表達(dá)的組織特異性和光應(yīng)答特性,明晰其對(duì)煙草黃酮積累及黃酮合成相關(guān)基因表達(dá)的影響。本研究初步揭示了苦蕎FtMYB5參與黃酮代謝調(diào)控的分子機(jī)理,為未來(lái)采用代謝工程技術(shù)提高苦蕎黃酮含量提供了理論參考。主要研究結(jié)果如下:1.根據(jù)苦蕎花期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),克隆獲得一條與擬南芥AtMYB111同源的R2R3-MYB基因序列,命名為FtMYB5。構(gòu)建pBridge-FtMYB5酵母表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化AH109酵母細(xì)胞,經(jīng)SD/-Trp/-His雙缺培養(yǎng)篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。β-半乳糖苷酶活性濾紙分析...

【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號(hào)說(shuō)明
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 植物黃酮
    2 植物黃酮的生物合成及調(diào)控
    3 植物MYB轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展
        3.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征與功能
        3.2 MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物黃酮代謝的調(diào)控
    4 苦蕎黃酮類化合物的研究進(jìn)展
    5 立題目的與意義
第二章 苦蕎轉(zhuǎn)錄因子FtMYB5基因的克隆及分子鑒定
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 菌株與載體
            1.1.3 主要試劑
            1.1.4 酵母單雜交所用培養(yǎng)基和溶液
            1.1.5 主要儀器
        1.2 方法
            1.2.1 苦蕎FtMYB5基因cDNA序列的克隆
            1.2.2 苦蕎FtMYB5基因DNA序列的克隆
            1.2.3 苦蕎FtMYB5基因的生物信息學(xué)分析
            1.2.4 酵母單雜交重組載體的構(gòu)建
            1.2.5 重組質(zhì)粒pBridge-FtMYB5酵母轉(zhuǎn)化
            1.2.6 β-半乳糖苷酶活性的濾紙分析
            1.2.7 FtMYB5亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建
            1.2.8 FtMYB5亞細(xì)胞定位質(zhì)粒提取
            1.2.9 擬南芥原生質(zhì)體制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
    2. 結(jié)果與分析
        2.1 苦蕎FtMYB5 cDNA序列的擴(kuò)增
        2.2 苦蕎FtMYB5 DNA序列的擴(kuò)增
        2.3 苦蕎FtMYB5生物信息學(xué)分析
            2.3.1 氨基酸序列分析及多序列比對(duì)
            2.3.2 進(jìn)化樹(shù)分析
        2.4 FtMYB5酵母單雜交重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.5 重組質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化
        2.6 陽(yáng)性菌株β-半乳糖苷酶活性的濾紙分析
        2.7 FtMYB5亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建
        2.8 FtMYB5亞細(xì)胞定位分析
    3 討論
第三章 苦蕎FtMYB5基因表達(dá)量與黃酮含量分析
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 主要試劑和藥品
            1.1.3 主要儀器
        1.2 方法
            1.2.1 苦蕎花期組織材料獲得
            1.2.2 芽期苦蕎光照及黑暗處理
            1.2.3 苦蕎樣品總RNA提取及cDNA制備
            1.2.4 熒光定量PCR
            1.2.5 苦蕎總黃酮提取及測(cè)定
    2 結(jié)果與分析
        2.1 苦蕎花期各組織黃酮含量分析
        2.2 花期苦蕎黃酮合成相關(guān)基因表達(dá)量分析
        2.3 光照及黑暗條件下芽期苦蕎黃酮含量分析
        2.4 光照對(duì)芽期苦蕎黃酮合成相關(guān)基因表達(dá)量的影響
    3 討論
第四章 苦蕎FtMYB5啟動(dòng)子P_FtMYB5的克隆及功能鑒定
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 菌株與載體
            1.1.3 主要試劑
            1.1.4 培養(yǎng)基
            1.1.5 主要儀器
        1.2 方法
            1.2.1 苦蕎FtMYB5啟動(dòng)子P_FtMYB5的克隆
            1.2.2 苦蕎FtMYB5啟動(dòng)子P_FtMYB5序列分析
            1.2.3 苦蕎FtMYB5啟動(dòng)子P_FtMYB5表達(dá)載體的構(gòu)建
            1.2.4 苦蕎FtMYB5啟動(dòng)子P_FtMYB5表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化
            1.2.5 擬南芥轉(zhuǎn)化
            1.2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥種植
            1.2.7 擬南芥幼苗光照及黑暗處理
            1.2.8 擬南芥GUS染色
            1.2.9 擬南芥光照及黑暗處理?xiàng)l件下GUS基因表達(dá)量檢測(cè)
    2 結(jié)果與分析
        2.1 苦蕎FtMYB5啟動(dòng)子P_FtMYB5的克隆
        2.2 苦蕎FtMYB5啟動(dòng)子P_FtMYB5的生物信息學(xué)分析
        2.3 苦蕎FtMYB5啟動(dòng)子P_FtMYB5表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.4 陽(yáng)性擬南芥的篩選和鑒定
        2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥染色
        2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥光照及黑暗處理
    3 討論
第五章 苦蕎轉(zhuǎn)錄因子FtMYB5的轉(zhuǎn)基因功能鑒定
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 菌株與載體
            1.1.3 主要試劑
            1.1.4 主要儀器
            1.1.5 培養(yǎng)基
        1.2 方法
            1.2.1 FtMYB5植物表達(dá)載體的構(gòu)建
            1.2.2 FtMYB5植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
            1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化
            1.2.4 轉(zhuǎn)基因煙草的陽(yáng)性鑒定
            1.2.5 陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草的表型觀察
            1.2.6 陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草中黃酮合成途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量分析
            1.2.7 轉(zhuǎn)基因煙草中總黃酮及花青素含量分析
            1.2.8 轉(zhuǎn)基因煙草中黃酮醇含量分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 FtMYB5植物表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的篩選和鑒定
        2.3 轉(zhuǎn)基因煙草表型
        2.4 轉(zhuǎn)基因煙草中黃酮和花青素含量分析
        2.5 轉(zhuǎn)基因煙草中黃酮合成支路關(guān)鍵酶基因表達(dá)量分析
    3 討論
參考文獻(xiàn)
致謝
碩士期間發(fā)表論文



本文編號(hào)：3860544