發(fā)布時間：2024-07-11 04:27

　　本研究從實驗室的突變體庫中,篩選得到兩個早衰突變體,分別命名為es7和pls5。隨后分別對其開展了表型分析、基因定位與克隆、基因功能分析等相關(guān)工作,獲得的主要結(jié)果如下:1.通過⁶⁰Co輻射誘變93-11種子,篩選得到一個水稻早衰突變體es7。在大田種植條件下,播種60天左右時,下部葉片開始出現(xiàn)衰老,隨著植株的生長發(fā)育,衰老越來越嚴(yán)重。在高濃度二氧化碳條件下,光呼吸被抑制,es7表型可以得到恢復(fù)。生理指標(biāo)檢測分析發(fā)現(xiàn),es7突變體中,有大量H₂O₂積累,并且過氧化氫酶活性顯著降低,植株總抗氧化能力降低;同時衰老相關(guān)基因表達(dá)量都顯著升高。圖位克隆和測序分析發(fā)現(xiàn),在88kb范圍內(nèi),第9個ORF(LOC_Os07g46460)的第二個外顯子和內(nèi)含子銜接處(1292bp),有一個堿基發(fā)生了突變,由G突變?yōu)锳,導(dǎo)致mRNA缺失57個堿基,最終導(dǎo)致蛋白保守的purF-type谷氨酰胺轉(zhuǎn)移區(qū)域結(jié)構(gòu)異常。ES7基因編碼一個鐵氧還原蛋白依賴的谷氨酸合酶(Fd-GOGAT),是一個組成型表達(dá)的基因,并且其編碼的蛋白定位于葉...

【文章頁數(shù)】：96 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 葉片衰老的進(jìn)程和生理生化變化
        1.1.1 葉片衰老的進(jìn)程
        1.1.2 葉片衰老生理生化變化
    1.2 葉片衰老相關(guān)基因的研究
        1.2.1 葉綠體發(fā)育和葉綠素合成相關(guān)基因
        1.2.2 葉綠素降解相關(guān)基因
        1.2.3 蛋白質(zhì)合成及降解相關(guān)基因
        1.2.4 激素途徑相關(guān)基因
        1.2.5 其他途徑相關(guān)基因
    1.3 氮代謝與葉片衰老
        1.3.1 氮代謝與葉片衰老
        1.3.2 谷氨酰胺合酶/谷氨酸合酶循環(huán)
        1.3.3 植物中的谷氨酸合酶
        1.3.4 水稻中谷氨酸合酶研究進(jìn)展
    1.4 磷脂酰絲氨酸及其合成酶研究進(jìn)展
    1.5 本研究的目的和意義
第二章 水稻早衰突變體es7基因的圖位克隆與功能研究
    2.1 實驗材料
    2.2 實驗方法
        2.2.1 水稻種植條件
        2.2.2 DNA提取
        2.2.3 葉綠素含量測定
        2.2.4 CAT, T-AOC, GS活性測定
        2.2.5 H₂O₂, NO2
-含量測定
        2.2.6 GOGAT活性測定
        2.2.7 GDH活性測定
        2.2.8 候選基因分析
        2.2.9 總RNA提取
        2.2.10 第一鏈cDNA的合成
        2.2.11 熒光定量PCR
        2.2.12 互補(bǔ)載體構(gòu)建
        2.2.13 大腸桿菌轉(zhuǎn)化
        2.2.14 水稻遺傳轉(zhuǎn)化
        2.2.15 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建
        2.2.16 OsES7-pro::GUS載體構(gòu)建
        2.2.17 GUS染色
        2.2.18 p35S::ES7-GFP載體構(gòu)建
        2.2.19 水稻原生質(zhì)體的制備和瞬時表達(dá)
        2.2.20 游離氨基酸含量測定
        2.2.21 酵母雙雜交篩選
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 es7突變體表型分析
        2.3.2 es7突變體生理指標(biāo)檢測
        2.3.3 衰老相關(guān)基因表達(dá)量檢測
        2.3.4 候選基因確定
        2.3.5 ES7的基因克隆和功能驗證
        2.3.6 ES7在綠色組織中表達(dá)
        2.3.7 ES7定位于葉綠體
        2.3.8 ES7參與氮代謝
        2.3.9 ES7影響葉綠素的合成
        2.3.10 es7突變體在高CO₂條件下可以正常生長
        2.3.11 酵母雙雜交文庫篩選
    2.4 討論
        2.4.1 ES7對水稻的正常生長發(fā)育起重要作用
        2.4.2 ES7參與氮代謝和氨基酸的代謝
        2.4.3 ES7影響葉綠素的合成
        2.4.4 es7也是一個光呼吸突變體
第三章 水稻早衰突變體pls5基因的圖位克隆與功能研究
    3.1 實驗材料
    3.2 實驗方法
        3.2.1 農(nóng)藝性狀調(diào)查
        3.2.2 定位群體構(gòu)建
        3.2.3 遺傳分析
        3.2.4 光合速率測定
        3.2.5 CAT, T-AOC活性和H₂O₂含量測定
        3.2.6 MDA含量測定
        3.2.7 POD測定
        3.2.8 GSH-PX測定
        3.2.9 組織化學(xué)分析
        3.2.10 葉片透射電鏡觀察
        3.2.11 TUNEL實驗
        3.2.12 聚丙烯酰胺凝膠電泳
        3.2.13 基因定位
        3.2.14 候選基因分析
        3.2.15 RNA提取和熒光定量PCR
        3.2.16 互補(bǔ)載體構(gòu)建
        3.2.17 artificial microRNA(amiRNA)載體構(gòu)建
        3.2.18 p35S::PLS5-GFP載體構(gòu)建
        3.2.19 水稻原生質(zhì)體的制備和瞬時表達(dá)
        3.2.20 高溫誘導(dǎo)衰老
        3.2.21 水稻葉片總蛋白提取
        3.2.22 Western blot
        3.2.23 均一化膜蛋白酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建
        3.2.24 膜蛋白酵母雙雜交文庫篩選
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 pls5突變體表型分析
        3.3.2 葉綠素和光合指標(biāo)測定
        3.3.3 農(nóng)藝性狀考察
        3.3.4 衰老相關(guān)生理指標(biāo)測定
        3.3.5 pls5突變體葉綠體降解加速
        3.3.6 pls5突變體細(xì)胞衰老、凋亡加速
        3.3.7 pls5的遺傳分析
        3.3.8 基因定位
        3.3.9 候選基因分析
        3.3.10 PLS5基因克隆和功能驗證
        3.3.11 PLS5生物信息學(xué)分析
        3.3.12 PLS5在水稻中組成型表達(dá)
        3.3.13 PLS5蛋白定位于細(xì)胞膜和核膜
        3.3.14 PLS5在突變體中表達(dá)下調(diào)
        3.3.15 PLS5突變可使水稻葉片加速衰老
        3.3.16 高溫環(huán)境加速pls5衰老
        3.3.17 膜蛋白酵母雙雜交文庫篩選
    3.4 討論
        3.4.1 PLS5對于細(xì)胞的正常生長起重要作用
        3.4.2 PLS5突變可加速水稻衰老
        3.4.3 PLS5間接影響水稻產(chǎn)量
第四章 全文結(jié)論
    4.1 ES7參與氮代謝，影響衰老
    4.2 PLS5突變促進(jìn)細(xì)胞死亡，加速衰老
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介



本文編號：4005250

boshi