雞γ干擾素(Chicken interferon-gamma,ChIFN-γ)是一類具有抗病毒活性、抗細菌與抗寄生蟲的作用的細胞因子。實驗室前期發(fā)現轉ChIFN-γ煙草的腺毛密度增加,腺毛分泌物明顯增多,抗蟲性提高。通過全基因組表達譜芯片結合生物信息學分析,推測一條信號通路上的3個關鍵基因(CyP71、LBM1和IspH)與煙草腺毛發(fā)育相關性顯著。在IspH功能研究的基礎上,以剩余2個基因的功能進行研究,并通過原核表達純化目的蛋白、應用等溫量熱技術(ITC)研究ChIFN-γ與3個蛋白的互作,研究結果如下:(1)構建含植物過表達載體pSH737-CyP71和pSH737-LBM1的農桿菌LBA4404,通過蘸花法遺傳轉化擬南芥,收集種子進行抗性篩選,分別獲得到抗性植株50株和65株,基因組PCR呈陽性。GUS染色及表皮細胞顯微觀察顯示,轉CyP71擬南芥GUS染色葉片群不呈現深藍色,數量顯著增加100%;轉LBM1擬南芥GUS染色,表皮毛細胞均呈藍色,數量顯著增加100%,LBM1基因的表達與擬南芥表皮毛的發(fā)育呈正相關。(2)將ChIFN-γ、IspH構建到原核表達載體獲得pET28a...

【文章頁數】：93 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 前言
    1.1 干擾素的研究進展
    1.2 ChIFN-γ的研究進展
    1.3 煙草腺毛的研究進展
        1.3.1 煙草腺毛的形態(tài)學特征
        1.3.2 煙草腺毛的結構與類型
        1.3.3 調控煙草腺毛發(fā)育相關基因的研究進展
    1.4 調控擬南芥的表皮毛發(fā)育特異性表達的基因
    1.5 研究蛋白質與蛋白質的相互作用的研究方法
        1.5.1 酵母雙雜交系統(tǒng)
        1.5.2 等溫滴定量熱法
        1.5.3 表面等離子共振技術
        1.5.4 免疫共沉淀技術
        1.5.5 GST-pull-down技術
    1.6 本研究的目的及意義
第二章 擬南芥的遺傳與轉化
    2.1 引言
    2.2 材料
        2.2.1 菌種和植物材料
        2.2.2 主要試劑
        2.2.3 實驗儀器
        2.2.4 染色液和培養(yǎng)基的配制
    2.3 實驗方法
        2.3.1 擬南芥的培養(yǎng)
        2.3.2 擬南芥的遺傳轉化
        2.3.3 擬南芥T1代轉基因種子的篩選
        2.3.4 擬南芥基因組的提取
        2.3.5 抗性植株PCR檢測
        2.3.6 GUS組織化學染色檢測抗性植株
    2.4 結果與分析
        2.4.1 抗性植株的篩選與鑒定
        2.4.2 轉基因擬南芥性狀的觀察
    2.5 討論
第三章 ChIFN-γ與IspH、CyP71和LBM1的蛋白互作
    3.1 引言
    3.2 材料
        3.2.1 細菌與質粒
        3.2.2 主要實驗儀器
        3.2.3 主要試劑
        3.2.4 試劑盒
        3.2.5 酶切引物的設計
        3.2.6 試劑的配置
    3.3 實驗方法
        3.3.1 目的DNA片段的擴增
        3.3.2 PCR產物的檢測與膠回收
        3.3.3 目的基因質粒的提取
        3.3.4 質粒PCR檢測目的基因及膠回收
        3.3.5 pET28a、pET30a質粒的提取
        3.3.6 pET28a、pET30a質粒的雙酶切及回收
        3.3.7 ChIFN-γ、IspH、CyP71和LBM1的雙酶切及其產物回收
        3.3.8 目的基因Ch IFN-γ、IspH、Cy P71、LBM1和表達載體的連接
        3.3.9 感受態(tài)大腸桿菌（E.coli BL(21)）的制備
        3.3.10 連接產物的轉化
        3.3.11 重組質粒的鑒定
        3.3.12 重組質粒的測序
        3.3.13 重組蛋白的小量誘導表達
        3.3.14 SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達
        3.3.15 重組蛋白的大量誘導表達
        3.3.16 重組蛋白的純化
        3.3.17 目的蛋白的復性透析
        3.3.18 考馬斯亮藍法測定蛋白濃度
        3.3.19 Western Blot檢測ChIFN-γ、IspH、CyP71、LBM1蛋白
        3.3.20 等溫滴定量熱法檢測蛋白間的相互作用
    3.4 實驗結果與分析
        3.4.1 ChIFN-γ、Isp H、CyP71和LBM1基因PCR擴增
        3.4.2 菌落PCR檢測重組表達載體
        3.4.3 質粒PCR檢測重組質粒
        3.4.4 雙酶切鑒定重組質粒
        3.4.5 重組蛋白小量誘導表達
        3.4.6 重組蛋白的大量誘導表達
        3.4.7 離子交換層析純化ChIFN-γ和IspH蛋白
        3.4.8 親和層析純化CyP71和LBM1蛋白
        3.4.9 純化蛋白的濃度測定
        3.4.10 Western Blot檢測ChIFN-γ、IspH、CyP71和LBM1蛋白
        3.4.11 等溫滴定量熱儀檢測蛋白互作
    3.5 討論
第四章 總結與展望
    4.1 總結
    4.2 展望
參考文獻
附錄
致謝
在讀期間參與科研項目
在讀期間發(fā)表文章



本文編號：3761858