植物發(fā)育到一定的時期時,在合適的內(nèi)部及外界因素的共同作用下,其個體將由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,正常開花是以種子和果實為收獲對象的農(nóng)作物獲得高產(chǎn)的重要前提。一般情況下,植物花器官發(fā)育是一個不可逆的過程,然而一些植物在特殊的自身條件和環(huán)境條件影響下,已形成的花器官會再次進(jìn)入營養(yǎng)生長狀態(tài),從而發(fā)生花器官逆轉(zhuǎn)。柳枝稷(Panicum virgatum L.)是一種高大型禾草植物,具有耐旱、耐瘠薄、易于管理、生物質(zhì)產(chǎn)量高等特點,在國際上被認(rèn)定為模式能源作物。本研究發(fā)現(xiàn),伸長期第4期的柳枝稷材料‘Alamo’的莖端已發(fā)育出長為1 cm左右的幼穗,以該時期莖端為外植體進(jìn)行體外培養(yǎng)發(fā)生了花器官逆轉(zhuǎn),通過解剖學(xué)、組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)分析對此進(jìn)行了證實,之后通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)獲得了可能參與到花器官逆轉(zhuǎn)中的基因,并對其中部分基因的功能進(jìn)行了生物學(xué)驗證。主要研究結(jié)果如下:1.柳枝稷莖端在穗芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+3 mg.L~(-1) 6-BA)上形成了不同類型的再生芽。通過對再生芽形態(tài)及分布特征分析發(fā)現(xiàn),第一類再生芽由外植體節(jié)上所攜帶的腋芽發(fā)育而來,第二類再生芽由外植體節(jié)上誘導(dǎo)出的愈傷組織分化而來,第三類再生芽由柳枝稷幼穗上的小花原基發(fā)育而來。通過對第三類再生芽及其相鄰的未完全逆轉(zhuǎn)小花和正常小花進(jìn)行組織切片觀察發(fā)現(xiàn),第三類再生芽中原本應(yīng)發(fā)育成花器官的組織已退化,其生長點處形成凸起,重新進(jìn)入了營養(yǎng)生長,而與其相鄰的未完全逆轉(zhuǎn)小花中雖有內(nèi)外稃及雄蕊存在,但中心位置無胚珠結(jié)構(gòu),而是形成了球狀營養(yǎng)器官。這些結(jié)果表明第三類再生芽是由小花生長點發(fā)育模式轉(zhuǎn)變而來,而非小花中形成的不定芽,即柳枝稷幼穗誘導(dǎo)產(chǎn)生的再生芽來自花器官逆轉(zhuǎn)。2.對穗芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的柳枝稷花逆轉(zhuǎn)材料和MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的體外花發(fā)育材料以及未培養(yǎng)的幼穗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,根據(jù)不同材料所處的發(fā)育時期及不同的發(fā)育方向推測認(rèn)為,花逆轉(zhuǎn)材料與另兩組材料相比均存在表達(dá)量差異而另兩組材料相比無表達(dá)量差異的基因可能參與到花器官逆轉(zhuǎn)。通過該方法共篩選出517個基因,經(jīng)多個數(shù)據(jù)庫注釋分析發(fā)現(xiàn),柳枝稷體外花器官逆轉(zhuǎn)與細(xì)胞信號傳導(dǎo)、能量代謝、蛋白轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多個生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)。此外,通過將篩選獲得的517個基因與花發(fā)育相關(guān)基因?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn),其中不存在已發(fā)表的影響花發(fā)育的基因,該結(jié)果表明花器官逆轉(zhuǎn)與花發(fā)育存在著一定的差異性。然而通過對柳枝稷中花發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn),開花促進(jìn)基因AP1在花逆轉(zhuǎn)材料中表達(dá)水平下降,開花抑制基因TEM1/TEM2在花逆轉(zhuǎn)材料中表達(dá)水平升高,但其變化幅度在兩組對比中未全部達(dá)到2倍,該結(jié)果表明花器官逆轉(zhuǎn)與花發(fā)育同樣存在一定的聯(lián)系。3.通過過量表達(dá)4個在花器官逆轉(zhuǎn)材料中高水平表達(dá)的基因發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表現(xiàn)出葉面積增大或花期延遲或花器官發(fā)育不正常的現(xiàn)象,然而其均為表現(xiàn)出完整的花器官逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。對該現(xiàn)象分析發(fā)現(xiàn),花器官逆轉(zhuǎn)可能涉及到抑制花器官發(fā)育、花器官分生組織發(fā)育模式轉(zhuǎn)變及營養(yǎng)生長的促進(jìn)等多個進(jìn)程,單個基因過量表達(dá)可能只參與到了其中的一個過程,而花器官逆轉(zhuǎn)是這些進(jìn)程共同作用的結(jié)果,要獲得完整的花器官逆轉(zhuǎn)需要對更多基因同時進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。4.PvSTK1基因編碼一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)該蛋白在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布。過表達(dá)PvSTK1基因使擬南芥(Arabidopsis thaliana)花期推遲,基部小花不育。通過對花發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因植株中開花促進(jìn)基因AP1、AG、FT及LFY的表達(dá)量降低,而開花抑制基因FLC和SVP的表達(dá)量升高,這表明PvSTK1基因影響到了光周期、春化及自主途徑等多個花發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò),且處于這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游。對轉(zhuǎn)基因植株中花序基部不育小花分析發(fā)現(xiàn),其花粉活力正常,然而胚珠在開花后逐漸萎縮。使用野生型擬南芥花粉進(jìn)行授粉發(fā)現(xiàn),花序基部不育小花仍保持不育,表明PvSTK1基因通過影響胚珠來使擬南芥小花不育。本研究首次在柳枝稷中發(fā)現(xiàn)了并證實了體外花器官逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象,通過轉(zhuǎn)錄組分析較為全面地研究了可能參與到花器官逆轉(zhuǎn)調(diào)控中的517個基因,并對部分基因的生物學(xué)功能進(jìn)行了研究,從新的角度研究了植物營養(yǎng)生長與生殖生長的發(fā)育調(diào)控,為柳枝稷及其他植物花發(fā)育調(diào)控研究提供了新的基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S578
【部分圖文】：

etal. 2016）。與 FT 基因在擬南芥中的表達(dá)模式類似，Hd3a 也只在水稻的葉片中表達(dá)，其產(chǎn)物通過微管組織運(yùn)輸?shù)角o尖分生組織行使功能（Tamaki et al. 2007; Sun et al. 2014;孔德艷等 2016（）圖1-1）。在短日照影響水稻開花調(diào)控中有一個水稻中特有的基因Earlyheadingdate1（Ehd1）能夠激活 Hd3a 基因的表達(dá)（Doiet al. 2004）。Ehd1 的表達(dá)可以由 OsGI 通過 OsMADS51 激活，也可以直接被 OsGI 激活，此外 Ehd1 還可以被玉米（Zea mays L.）Indeterminate1（ID1）基因的同源基因 Early heading date 2（Ehd2）激活（Kim et al. 2007a; Matsubara et al. 2008; Itoh et al. 2010）。Hd3a 被運(yùn)輸?shù)角o尖分生組織后能夠被莖端細(xì)胞中的 GF14c（G-box factor14-3-3c）識別并形成復(fù)合體，然而 GF14c

圖 1-3 控制花發(fā)育的“ABCDE 模型”(許智宏等 2015；瞿禮嘉等 2006）Fig. 1-3 The “ABCDE model” controling flower development.在擬南芥中，A 類基因包括 APETALA 1（AP1）和 APETALA2（AP2），無論是 ap1突變體還是 ap2 突變體均表現(xiàn)外部兩輪花器官變異，表明 AP1 基因和 AP2 基因功能并不冗余，二者共同影響著第 1、2 輪花器官的發(fā)育（Bowmanet al. 1991;Jofukuet al. 1994;Causier et al. 2010）。B 類基因包括 APETALA 3（AP3）和 PISTILLATA（PI），它們同樣共同影響著第2、3輪花器官的發(fā)育（Krizeketal. 1996）。C類基因包括AGAMOUS（AG）。在擬南芥中，ABC 類基因中，AP1、AP3、PI、AG 屬于 MIKC 類 MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子家族，AP2 屬于 AP2/EREBP 轉(zhuǎn)錄因子家族（Irish, 2017），這表明 ABC 類基因是通過調(diào)控其它基因的轉(zhuǎn)錄模式來影響花器官的發(fā)育。由前文可知，影響花器官起始的信號途徑主要有光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑、自主途徑和年齡途徑，而這些途徑在傳遞開花信號的過程中都涉及 FT 和 SOC1 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，最終激活花分生組織決定基因 LFY 和 AP1。AP1 基因是“ABC 模型”中的 A 類基因，然而該基因突變后不但影響花器官第 1、2 輪的發(fā)育，同時也會引起開花時間的延遲，因此人們也將其認(rèn)為是花分生組織決定基因（Bowmanet al. 1991）。隨著

西北農(nóng)林科技大學(xué)博士學(xué)位論文四聚體，進(jìn)而激活或抑制靶基因的表達(dá)，達(dá)到調(diào)控特定區(qū)域花器官發(fā)育的目標(biāo)。在擬南芥中，AP1-SEP-AP1-SEP 四聚體控制萼片的發(fā)育，PI-SEP-AP1-AP3 四聚體控制花瓣的發(fā)育，PI-SEP-AG-AP3 四聚體控制雄蕊的發(fā)育，AG-SEP-AG-SEP 四聚體控制心皮的發(fā)育，SEP-SHP-STK-AG 四聚體控制胚珠的發(fā)育（圖 1-4）（Theiβen, 2001）。由于 A、C 兩種功能的基因存在相互抑制的作用，當(dāng) A 類基因突變后，第 1、2 輪對應(yīng)四聚體分別轉(zhuǎn)變成第 4、3 輪所對應(yīng)四聚體，當(dāng) C 類基因突變后，第 3、4 輪對應(yīng) 4 具體分辨轉(zhuǎn)變成第 2、1 輪所對應(yīng)四聚體，這也揭示了 A 基因突變體花器官由外向內(nèi)分別為心皮、雄蕊、雄蕊、心皮以及 C 基因突變體由外向內(nèi)分別是萼片、花瓣、花瓣、萼片的結(jié)構(gòu)形成機(jī)理（Causier et al. 2010; Theiβen et al. 2016）。

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本文編號：2813698