大豆(Glycine max(L.)Merr)不僅是重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物,因其富含異黃酮等黃酮類化合物在醫(yī)藥、保健方面也備受關(guān)注。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,利用基因工程手段改良大豆品質(zhì)已經(jīng)成為可能,本研究優(yōu)化了大豆胚尖遺傳轉(zhuǎn)化體系,構(gòu)建了高效的過表達(dá)載體,將GmMYB12B2基因轉(zhuǎn)入大豆,并完成轉(zhuǎn)基因株系的檢測。構(gòu)建過表達(dá)載體pCHF-3300-GmMYB12B2(35S啟動(dòng)子)和pBA-002-GmMYB12B2(大豆種子特異性啟動(dòng)子ProGmOLE8)。以吉林35大豆胚尖為外植體,對(duì)胚尖劃傷的方式,農(nóng)桿菌侵染方式及時(shí)間,Basta篩選劑濃度等可能影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:吉林35胚尖三種劃傷方式中縱向劃傷植株再生率最高,農(nóng)桿菌侵染過程中真空侵染最佳時(shí)間15min,搖床最佳侵染時(shí)間為5h,且搖床5h比真空15min侵染植株的轉(zhuǎn)化率高。在誘芽和抽莖階段向培養(yǎng)基中添加篩選劑Basta濃度為1.8 mg/L篩選效果最好。綜合這幾項(xiàng)因素,優(yōu)化后的體系減少了假陽性的出現(xiàn),同時(shí)胚尖外植體具有高再生能力,在一定程度上縮短了培養(yǎng)周期,說明優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化體系是可行的。利用PCR、PAT蛋白試紙條、Southern blot及qRT-PCR方法分別檢測和驗(yàn)證每個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件。PCR和PAT蛋白試紙條初步證明T_0代中有3株(T_0-4、T_0-5、T_0-7)為陽性轉(zhuǎn)GmMYB12B2過表達(dá)株系;利用Southern blot雜交進(jìn)一步驗(yàn)證了T_1代株系,結(jié)果證明3株(T_1-4、T_1-5、T_1-7)均為陽性;以吉林35為對(duì)照,通過qRT-PCR方法檢測了T_1代轉(zhuǎn)基因株系中GmMYB12B2的表達(dá)情況,與野生型相比均呈顯著性提高,同時(shí)檢測了異黃酮代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量變化,其中DFR和FLS的表達(dá)量與野生型呈顯著差異,CHS的表達(dá)量為極顯著差異。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S565.1
【部分圖文】：

概述濟(jì)作物和糧食作物，除了富含蛋白質(zhì)、分也引起了研究者的關(guān)注[65]。大豆異黃含量相對(duì)較少，主要存在于豆科植物中要作用，成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。構(gòu)和性質(zhì)黃酮類化合物，是以3-苯并砒喃酮為母明：大豆中含有多種大豆異黃酮化合物素，黃豆黃素等[66]。大豆異黃酮只存在,68]。在不同時(shí)期不同部位的大豆異黃酮最高，其次是花，莖中的含量較少[69]。

第二章 大豆胚尖遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化探究胚尖劃傷方式、侵染方式及時(shí)間等可能影響轉(zhuǎn)化效率的因素，進(jìn)一步確定適合優(yōu)化后體系的篩選劑篩選濃度。從而提高吉林 35 胚尖遺傳轉(zhuǎn)化體系的轉(zhuǎn)化效率。2.2.4 劃傷處理對(duì)植株誘導(dǎo)率的影響傷口對(duì)于農(nóng)桿菌侵染而言是必不可少的條件之一，而傷口所處的位置，深度關(guān)乎著胚尖外植體是否能發(fā)育成完整的植株。初生葉位于胚尖頂端分生組織的中心位置，而在頂芽基部及側(cè)芽基部通常分化出很多叢生芽[86]。本環(huán)節(jié)以吉林 35胚尖外植體為研究對(duì)象，通過顯微鏡觀察，去掉胚尖頂端處的兩片真葉，在去掉真葉的分生組織處用刀片進(jìn)行劃傷處理，深度約為 2mm，分別以橫向、縱向、十字三種方式劃傷，如圖 2.2 所示。三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理切取 50 個(gè)外植體，通過觀察外植體的生長狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

第二章 大豆胚尖遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化長狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)抗性植株的數(shù)量和誘導(dǎo)率。.2.6 篩選劑濃度的確定.2.6.1 篩選劑致死濃度的確定以吉林 35 胚尖遺傳轉(zhuǎn)化體系為基礎(chǔ)，通過調(diào)整篩選劑的濃度找到最適的值。在共培養(yǎng)結(jié)束后，向誘芽培養(yǎng)基中加入不同濃度 Basta 篩選劑，其濃度分別為：0.0 mg/L、0.5 mg/L 、1.0 mg/L 、1.5 mg/L、2.0 mg/L。每組設(shè)置重復(fù)，每次處理外植體 50 個(gè)左右。通過觀察外植體的生長情況，統(tǒng)計(jì)抗性的數(shù)量，進(jìn)而確定篩選劑的致死濃度。

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