【摘要】：月季(Rosa chinensis)是我國傳統(tǒng)十大名花之一,原產(chǎn)于中國,距今已有二千多年的栽培史。月季喜溫暖濕潤、光照充足的環(huán)境,高溫會使月季進入半休眠狀態(tài)。我國南方地區(qū),夏季氣候炎熱,影響很多月季品種的生長發(fā)育,高溫往往還伴隨著高濕情況,使月季病蟲害加重,嚴重降低了月季的開花品質(zhì),導致其觀賞性不能達到最佳水平。目前關(guān)于月季耐熱品種的選育主要依靠田間觀察和傳統(tǒng)的雜交育種,耗費周期較長,因此,了解月季響應高溫脅迫的分子機制,利用基因工程技術(shù)手段定向、高效地改善月季的耐熱性具有重要意義。小分子熱激蛋白(small Heat Shock Protein,sHSP)是植物響應熱脅迫中重要的功能蛋白,為了揭示月季sHSP基因抗熱的分子機制,本研究前期對‘月月紅’進行48°C熱處理0、1、2、6、12h,通過轉(zhuǎn)錄組測序,獲得13個差異表達的unigenes,結(jié)合qRT-PCR,挑選表達水平顯著上調(diào)的5個候選基因,進行基因的克隆;再通過ExPASy protparam、DNAMAN、MEGA對所得基因的氨基酸序列進行生物信息學分析、保守結(jié)構(gòu)域分析和聚類分析;結(jié)合sHSP研究現(xiàn)狀,挑選目的基因,構(gòu)建亞細胞定位載體,瞬時轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiana tabacum),確定其在細胞中的定位;構(gòu)建超量表達載體,異源轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabidopsis thaliana),獲得轉(zhuǎn)基因陽性苗并進行耐熱性初探。主要研究結(jié)果如下:1、結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR結(jié)果,篩選得到5個表達水平有極顯著上調(diào)的sHSP基因,RcHSP18.1、RcHSP17.9、RcHSP17.8A、RcHSP26.5和RcHSP24.8,并克隆得到了全長序列。氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn):RcHSP18.1、RcHSP17.9、RcHSP17.8A、RcHSP26.5和RcHSP24.8編碼的氨基酸序列均含有植物sHSP特有的ACD保守結(jié)構(gòu)域(α-crystallin domain),包括一組β2-β9基序,和一個保守的I/V-X-I/V基序;聚類分析表明RcHSP17.8A、RcHSP18.1屬于CI類,RcHSP17.9屬于CII類,RcHSP26.5屬于M類,RcHSP24.8屬于P類。2、構(gòu)建了35S::RcHSP18.1-YFP、35S::RcHSP17.9-YFP、35S::RcHSP17.8A-YFP、35S::RcHSP24.8-YFP亞細胞定位載體,瞬時轉(zhuǎn)化煙草,結(jié)果表明:三個胞質(zhì)類‘月月紅’小分子熱激蛋白均定位于細胞質(zhì)中,說明它們在胞質(zhì)中發(fā)揮作用,葉綠體類小分子熱激蛋白RcHSP24.8則定位于葉綠體中,可能在熱脅迫下保護光合系統(tǒng)。3、獲得了35S::RcHSP18.1、35S::RcHSP17.9、35S::RcHSP17.8A、35S::RcHSP24.8超量表達載體,通過浸花法侵染哥倫比亞型擬南芥,經(jīng)過抗性篩選和半定量RT-PCR檢測,分別獲得8、12、18、7棵T_1代陽性苗,對T_2代種子進行分離比統(tǒng)計,獲得4個單拷貝株系,35S::RcHSP18.1 OE-9、35S::RcHSP17.8A OE-5、35S::RcHSP17.8A OE-7、35S::RcHSP24.8 OE-9,對所收的單拷貝株系的T_3代種子進行篩選,得到6個純合株系,分別為:35S::RcHSP18.1 OE-9-11、35S::RcHSP17.8A OE-5-6、35S::RcHSP17.8A OE-7-10、35S::RcHSP24.8 OE-9-5、35S::RcHSP24.8 OE-9-9、35S::RcHSP24.8 OE-9-10。4、對所得的純合株系幼苗進行耐熱性初探,結(jié)果證明,5d苗齡的幼苗在皿中經(jīng)45℃,3h處理后,22℃恢復5d,RcHSP24.8 OE-9-5超表株系的存活率為47%,野生型的存活率為35%,RcHSP24.8 OE-9-5超表株系表現(xiàn)出較強的耐熱性。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S685.12
【圖文】：

圖 1-1 活性氧和抗氧化防御機制（Gill 2010）Fig. 1-1 ROS and antioxidants defense mechanism（Gill 2010）。

8圖 1-2 擬南芥熱脅迫響應的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（Ohama 2016）Fig. 1-2 A Transcriptional Regulatory Network involved in the Heat Stress Response inArabidopsis（Ohama 2016）4 植物 sHSPs 研究概況4.1 植物 HSP 簡介熱激蛋白最早發(fā)現(xiàn)于果蠅中，1974 年 Tissieres 首次在果蠅熱激唾液腺中分離得到；1979 年，Barnett 在熱激處理的豌豆（Pisum sativum）和煙草組織培養(yǎng)細胞中發(fā)現(xiàn)了植物熱激蛋白。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn) HSP 幾乎存在于整個生物界。

圖 1-3 小分子熱激蛋白分子伴侶模型（Haslbeck 2015）Fig. 1-3 Model for the chaperone function of sHSP (Haslbeck 2015)

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李靜婷;王健勝;楊風嶺;;小麥MITE轉(zhuǎn)座子對sHSP基因的表達調(diào)控研究[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學;2015年12期

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1 王寧樂;月季耐熱相關(guān)sHSP基因的克隆和功能初探[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2019年

本文編號：2806579