【摘要】：誘導(dǎo)抗性是植物生長過程中抵御各種脅迫的重要手段。蛋白激發(fā)子具有誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗逆性的特點,在生物防控中具有重要的應(yīng)用前景。因此對轉(zhuǎn)激發(fā)子植株抗性機制研究不僅對植物異源基因表達功能分析提供參考,也對植株抗逆性遺傳改良具有重要的理論與實踐意義。本課題組前期從極細鏈格孢(Alternariatenuissima)中分離得到一個蛋白激發(fā)子PeaT1,并獲得了異源表達PeaT1水稻純合株系。本文研究了蛋白激發(fā)子PeaT1在水稻抗旱中的功能,初步闡述了 PeaT1在水稻抗旱中的作用機制。結(jié)果如下:(1)轉(zhuǎn)PeaT1水稻抗旱性顯著增強。轉(zhuǎn)PeaT1水稻在抗旱復(fù)水后,存活率比野生型水稻提高20%;抗旱相關(guān)物質(zhì)包括脫落酸、葉綠素和脯氨酸含量在抗旱過程中顯著提高,丙二醛含量顯著下降。qRT-PCR 檢測證明,抗旱相關(guān)基因OsCPK9 OsSKIPa,OsNCED2,OsNAC9,OsTPKb,和OsEREBP1在轉(zhuǎn)PeaT1水稻中的表達量顯著高于野生型。(2)轉(zhuǎn)PeaT1水稻中的脅迫相關(guān)蛋白高水平表達。利用Label free技術(shù)在野生型和轉(zhuǎn)基因水稻中共鑒定出蛋白4493個,達到顯著差異水平蛋白57個,其中上調(diào)32個,下調(diào)25個。GO分析表明差異蛋白主要參與新陳代謝、脅迫反應(yīng)、蛋白代謝、細胞活動及生物進程等過程,其中參與脅迫反應(yīng)的蛋白SKIP/SNW變化量最大,且在轉(zhuǎn)基因中表達量較高。(3)PeaT1與水稻OsMIOX蛋白在體內(nèi)和體外互作。酵母轉(zhuǎn)化實驗發(fā)現(xiàn)在50 mM 3-AT條件下PeaT1自激活現(xiàn)象可以抑制,通過酵母雙雜篩選水稻葉片cDNA文庫,初步獲得9個候選互作蛋白,進一步驗證發(fā)現(xiàn)肌醇加氧酶(OsMIOX)與PeaT1在酵母中特異性結(jié)合,并利用雙分子熒光互補(BIFC)和Pull-down技術(shù)對互作真實性進行驗證。(4)qRT-PCR和亞細胞定位結(jié)果表明,OsMIOX在轉(zhuǎn)PeaT1水稻抗旱過程中表達量顯著上調(diào);原位雜交顯示OsMIOX主要在葉肉細胞和花藥中表達。OsMIOX-GFP與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Marker蛋白共定位,表明OsMIOX蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上發(fā)揮作用。(5)構(gòu)建OsMOX過表達載體和敲除載體,獲得過表達陽性水稻株系10株,基因敲除水稻株系6株。對過表達OsMIOX水稻進行抗旱脅迫,轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),有743個顯著差異基因,其中上調(diào)基因534個,下調(diào)基因209個。GO與KEGG分析結(jié)果表明差異基因主要富集植物激素脫落酸,茉莉酸和糖代謝途徑。綜上所述,激發(fā)子PeaT1通過與OsMIOX互作并影響逆境脅迫相關(guān)基因表達來提高水稻的抗旱性。此研究不僅為激發(fā)子轉(zhuǎn)基因抗性機制研究提供了一定的理論參考,也對水稻抗旱分子輔助育種的遺傳改良具有重要的意義。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S511
【圖文】：

圖１－１病原菌誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗性示意圖（Ｐｉｅｔｅｒｓｅｅｔａｌ．，２０１４）逡逑子識別模式逡逑Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ邋ｓｉｔｅ邋ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ邋ｒｅｐｅａｔ邋ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ邋ｇｅｎｅ）基因，廣泛存在于基因進化中最快的．表現(xiàn)為基因數(shù)量的增多和病原菌壓力下導(dǎo)致的基因序的受體（Ｈａｙａｓｈｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１０；邋Ｊａｃｏｂ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１３；邋Ｋａｎｚａｋｉ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１２）。根據(jù)邋的不同可以分為兩大類，一類是具有白細胞介素－１受體結(jié)構(gòu)域的稱之為７的邋ＣＣ邋結(jié)構(gòu)域的稱之為邋ＣＭＬｓ邋（Ｇｒｉｅｂｅｌ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１４；邋Ｍａｅｋａｗａ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１１）。ＣＴ與雙子葉植物都存在，而基因只在雙子葉植物中（Ｊａｃｏｂｅｔａｌ．，２０１３；動物中，結(jié)構(gòu)上相似的核苷酸結(jié)合受體位點與植物中的識別不盡相同（Ｇａｗａ邋ｅｔａｌ．，２０１１）．動物中的基因數(shù)目比較少，推測可能是適應(yīng)免疫系統(tǒng)來別，從而導(dǎo)致基因數(shù)量的減少。同時與植物ＭＪｆｅ免疫信號相比．ＮＯＤ－Ｌ域（Ｔｉｎｇｅｔａｌ．，２０１０；Ｖｏｎｅｔａｌ．，２０１３）。然而分子結(jié)構(gòu)研[偨峁礱鰨芴逶諳嗨頻墓δ埽際峭ü藕糯寄Ｊ嚼唇惺侗鸕拇蚩牘乇眨粒模薪峒せ鈄刺ǎ齲酰澹簦幔歟�，２０１３）．灾u參錚危蹋壹せ畹哪Ｐ橢校味說模裕桑一蚴悄苡牒慫嶠岷銜壞閫ü姿嶧蛉チ姿嶧墓湯創(chuàng)蚩蜆乇眨ǎ裕幔耄耄澹鑠澹幔睿

本文編號：2806677