發(fā)布時(shí)間：2020-08-21 13:45

【摘要】：天麻是我國(guó)一種名貴的中藥材,具有抗驚厥作用,神經(jīng)保護(hù),抗炎以及免疫調(diào)節(jié)等多種功能。目前,關(guān)于天麻的研究主要集中于對(duì)天麻的粗提物或者天然化學(xué)成分的藥理研究以及產(chǎn)品開(kāi)發(fā),還未有任何關(guān)于天麻中microRNA的報(bào)道。microRNA(mi RNA)是一類(lèi)長(zhǎng)19-24nt非編碼的小RNA分子,廣泛地參與了人類(lèi)疾病的代謝過(guò)程。它能夠通過(guò)與靶mRNA結(jié)合,從而降解靶mRNA或者抑制其翻譯。mi RNA通過(guò)對(duì)多種信號(hào)通路上的關(guān)鍵的因子進(jìn)行調(diào)控,從而影響細(xì)胞的增殖、分化和衰老等過(guò)程。本項(xiàng)目系統(tǒng)的鑒定和分析了天麻小RNA,并從跨界的角度探討天麻miRNA在炎癥發(fā)生過(guò)程中的作用,為揭示天麻抗炎免疫的分子作用機(jī)制奠定基礎(chǔ),同時(shí)為miRNA的跨界調(diào)控提供新的證據(jù)。首先,利用Illumina高通量測(cè)序分析技術(shù)對(duì)天麻小RNA(sRNA)進(jìn)行了測(cè)序,得到了大量的天麻sRNA。在箭麻和禾麻的花莖芽與塊莖四個(gè)組織中分別得到了9,798,753個(gè)、10,713,576個(gè)、11,916,192個(gè)和11,229,380個(gè)測(cè)序read。經(jīng)過(guò)去低質(zhì)量、去接頭和去污染后,得到了9,666,044個(gè)、10,508,310個(gè)、11,763,094個(gè)和11,074,999個(gè)Clean reads數(shù)。再對(duì)clean序列進(jìn)行了長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示mi RNA和siRNA相對(duì)較多,推測(cè)其可能對(duì)于調(diào)節(jié)基因表達(dá)起重要作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了5718個(gè)天麻miRNA,其中天麻特有的全新miRNA共有52個(gè)。挑選10個(gè)候選miRNA(Gas-miR159,Gas-miR6478,Gas-miR148a-3p,Gas-miR99,Gas-miR143-3p,Gas-miR319f,Gas-miR396e,Gas-miR26a,Gas-miR01和Gas-miR02),利用qRT-PCR進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。10個(gè)候選miRNA在不同天麻組織中的相對(duì)表達(dá)水平與高通量測(cè)序結(jié)果基本一致。其次,利用qRT-PCR檢測(cè)了上述10個(gè)miRNA在天麻種子、米麻、白麻、箭麻幾個(gè)時(shí)期的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示,Gas-miR319f在種子、米麻和白麻時(shí)期表達(dá)量相差不大,但是到了箭麻時(shí)期Gas-miR319f會(huì)急劇升高到原來(lái)的20倍。對(duì)其中表達(dá)量較高且穩(wěn)定的天麻特有的Gas-miR01和Gas-miR02利用TargetScan和RNAhybrid軟件預(yù)測(cè)其在人類(lèi)基因組中的靶基因,并進(jìn)行KEGG分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gas-miR01和Gas-miR02均能靶向NF-κB信號(hào)通路上三個(gè)關(guān)鍵的炎癥發(fā)生相關(guān)基因A20、TNF-α和IκBα,提示該天麻中特有的兩個(gè)miRNA分子有可能作為一種重要的小RNA分子,跨界調(diào)控NF-κB信號(hào)通路上的關(guān)鍵基因,進(jìn)而參與人類(lèi)機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)等生理過(guò)程。進(jìn)一步利用qRT-PCR檢測(cè)分別灌胃天麻片煎煮液、天麻粉和天麻總RNA的實(shí)驗(yàn)小鼠各個(gè)組織中的Gas-miR01和Gas-miR02水平。結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組小鼠的各個(gè)組織中,天麻miRNA Gas-mi R01和Gas-miR02的含量均明顯高于對(duì)照組,證實(shí)Gas-miR01和Gas-miR02的確能夠通過(guò)胃腸道進(jìn)入到小鼠體內(nèi)。上述結(jié)果為進(jìn)一步研究天麻小RNA的跨界功效提供了基礎(chǔ)。最后,將Gas-miR01 mimics、Gas-miR02 mimics和miRNA negative control分別轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。Western Blotting結(jié)果顯示,Gas-miR01 mimics和Gas-miR02 mimics均能夠下調(diào)NF-κB信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白A20。NF-κB被激活時(shí),IKKβ磷酸化A20,從而抑制NF-κB進(jìn)一步的活化。A20作為NF-κB依賴(lài)的蛋白,起到了反饋調(diào)節(jié)的作用。這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)天麻類(lèi)消炎藥物提供了一個(gè)新的路徑,也為后續(xù)天麻miRNA作用機(jī)制的深入研究提供了新的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S567.239
【圖文】：

浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 天麻小 RNA 的鑒定與分析及其跨界調(diào)控初探(3) Length：原始 read 長(zhǎng)度。(4) Q>20 read：為天麻各樣本中堿基平均質(zhì)量值大于20 的 read 條數(shù)。(5) Q>20(%)：為 Q>20 read 條數(shù)占總 read 條數(shù)的百分比。(6) Q>10 read：為天麻各樣本中堿基平均質(zhì)量值大于10 的 read 條數(shù)。(7) Q>10(%)：為 Q>10 read 條數(shù)占總 reads 條數(shù)的百分比。(8) GC(%)：為天麻各樣本測(cè)序所得堿基中的 GC 含量。(9) Bud1：箭麻花莖芽； Bud2：禾麻花莖芽； Tuber1：箭麻塊莖； Tuber2：禾麻塊莖。

13圖 3.3 Clean 序列的長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)Fig.3.3 Length distribution of Clean sequences（A）clean total reads （B）clean unique readsBud1：箭麻花莖芽； Bud2：禾麻花莖芽； Tuber1：箭麻塊莖； Tuber2：禾麻塊莖。Bud1： jianma Bud；Bud2： hema Bud；Tuber1： jianma Tuber；Tuber2： hema Tuber

浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 天麻小 RNA 的鑒定與分析及其跨界調(diào)控初探3.1.3 樣本間 Reads 分析針對(duì) clean reads 的 total 數(shù)據(jù)，得出天麻的同一生長(zhǎng)時(shí)期的不同組織間和同種組織的不同生長(zhǎng)時(shí)期間的統(tǒng)計(jì)信息（圖 3.4）。其中，使用韋恩圖表示天麻箭麻花莖芽和塊莖以及禾麻花莖芽和塊莖樣本之間 clean reads 的分析。其中，棕紅色的部分表示前者的特有的 cleanreads 數(shù)；淺藍(lán)色的部分表示后者特有的 clean reads 數(shù)；中間重疊部分表示的是兩者共有的clean reads 數(shù)。組織間特異的 sRNA 在天麻中往往起著特有的作用。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2799452