【摘要】：天麻是我國一種名貴的中藥材,具有抗驚厥作用,神經(jīng)保護,抗炎以及免疫調(diào)節(jié)等多種功能。目前,關(guān)于天麻的研究主要集中于對天麻的粗提物或者天然化學(xué)成分的藥理研究以及產(chǎn)品開發(fā),還未有任何關(guān)于天麻中microRNA的報道。microRNA(mi RNA)是一類長19-24nt非編碼的小RNA分子,廣泛地參與了人類疾病的代謝過程。它能夠通過與靶mRNA結(jié)合,從而降解靶mRNA或者抑制其翻譯。mi RNA通過對多種信號通路上的關(guān)鍵的因子進行調(diào)控,從而影響細胞的增殖、分化和衰老等過程。本項目系統(tǒng)的鑒定和分析了天麻小RNA,并從跨界的角度探討天麻miRNA在炎癥發(fā)生過程中的作用,為揭示天麻抗炎免疫的分子作用機制奠定基礎(chǔ),同時為miRNA的跨界調(diào)控提供新的證據(jù)。首先,利用Illumina高通量測序分析技術(shù)對天麻小RNA(sRNA)進行了測序,得到了大量的天麻sRNA。在箭麻和禾麻的花莖芽與塊莖四個組織中分別得到了9,798,753個、10,713,576個、11,916,192個和11,229,380個測序read。經(jīng)過去低質(zhì)量、去接頭和去污染后,得到了9,666,044個、10,508,310個、11,763,094個和11,074,999個Clean reads數(shù)。再對clean序列進行了長度分布統(tǒng)計。統(tǒng)計結(jié)果顯示mi RNA和siRNA相對較多,推測其可能對于調(diào)節(jié)基因表達起重要作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了5718個天麻miRNA,其中天麻特有的全新miRNA共有52個。挑選10個候選miRNA(Gas-miR159,Gas-miR6478,Gas-miR148a-3p,Gas-miR99,Gas-miR143-3p,Gas-miR319f,Gas-miR396e,Gas-miR26a,Gas-miR01和Gas-miR02),利用qRT-PCR進行進一步的驗證。10個候選miRNA在不同天麻組織中的相對表達水平與高通量測序結(jié)果基本一致。其次,利用qRT-PCR檢測了上述10個miRNA在天麻種子、米麻、白麻、箭麻幾個時期的相對表達水平。結(jié)果顯示,Gas-miR319f在種子、米麻和白麻時期表達量相差不大,但是到了箭麻時期Gas-miR319f會急劇升高到原來的20倍。對其中表達量較高且穩(wěn)定的天麻特有的Gas-miR01和Gas-miR02利用TargetScan和RNAhybrid軟件預(yù)測其在人類基因組中的靶基因,并進行KEGG分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gas-miR01和Gas-miR02均能靶向NF-κB信號通路上三個關(guān)鍵的炎癥發(fā)生相關(guān)基因A20、TNF-α和IκBα,提示該天麻中特有的兩個miRNA分子有可能作為一種重要的小RNA分子,跨界調(diào)控NF-κB信號通路上的關(guān)鍵基因,進而參與人類機體免疫和炎癥反應(yīng)等生理過程。進一步利用qRT-PCR檢測分別灌胃天麻片煎煮液、天麻粉和天麻總RNA的實驗小鼠各個組織中的Gas-miR01和Gas-miR02水平。結(jié)果表明,實驗組小鼠的各個組織中,天麻miRNA Gas-mi R01和Gas-miR02的含量均明顯高于對照組,證實Gas-miR01和Gas-miR02的確能夠通過胃腸道進入到小鼠體內(nèi)。上述結(jié)果為進一步研究天麻小RNA的跨界功效提供了基礎(chǔ)。最后,將Gas-miR01 mimics、Gas-miR02 mimics和miRNA negative control分別轉(zhuǎn)染至293T細胞中。Western Blotting結(jié)果顯示,Gas-miR01 mimics和Gas-miR02 mimics均能夠下調(diào)NF-κB信號通路上的關(guān)鍵蛋白A20。NF-κB被激活時,IKKβ磷酸化A20,從而抑制NF-κB進一步的活化。A20作為NF-κB依賴的蛋白,起到了反饋調(diào)節(jié)的作用。這一發(fā)現(xiàn)為進一步開發(fā)天麻類消炎藥物提供了一個新的路徑,也為后續(xù)天麻miRNA作用機制的深入研究提供了新的理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S567.239
【圖文】：

浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 天麻小 RNA 的鑒定與分析及其跨界調(diào)控初探(3) Length：原始 read 長度。(4) Q>20 read：為天麻各樣本中堿基平均質(zhì)量值大于20 的 read 條數(shù)。(5) Q>20(%)：為 Q>20 read 條數(shù)占總 read 條數(shù)的百分比。(6) Q>10 read：為天麻各樣本中堿基平均質(zhì)量值大于10 的 read 條數(shù)。(7) Q>10(%)：為 Q>10 read 條數(shù)占總 reads 條數(shù)的百分比。(8) GC(%)：為天麻各樣本測序所得堿基中的 GC 含量。(9) Bud1：箭麻花莖芽； Bud2：禾麻花莖芽； Tuber1：箭麻塊莖； Tuber2：禾麻塊莖。

13圖 3.3 Clean 序列的長度分布統(tǒng)計Fig.3.3 Length distribution of Clean sequences（A）clean total reads （B）clean unique readsBud1：箭麻花莖芽； Bud2：禾麻花莖芽； Tuber1：箭麻塊莖； Tuber2：禾麻塊莖。Bud1： jianma Bud；Bud2： hema Bud；Tuber1： jianma Tuber；Tuber2： hema Tuber

浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 天麻小 RNA 的鑒定與分析及其跨界調(diào)控初探3.1.3 樣本間 Reads 分析針對 clean reads 的 total 數(shù)據(jù)，得出天麻的同一生長時期的不同組織間和同種組織的不同生長時期間的統(tǒng)計信息（圖 3.4）。其中，使用韋恩圖表示天麻箭麻花莖芽和塊莖以及禾麻花莖芽和塊莖樣本之間 clean reads 的分析。其中，棕紅色的部分表示前者的特有的 cleanreads 數(shù)；淺藍色的部分表示后者特有的 clean reads 數(shù)；中間重疊部分表示的是兩者共有的clean reads 數(shù)。組織間特異的 sRNA 在天麻中往往起著特有的作用。

【參考文獻】

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本文編號：2799452