【摘要】：青蒿(Artemisia annua L.)是具有悠久歷史的中國(guó)傳統(tǒng)藥用植物,青蒿素是治療瘧疾藥物中的最有效成分。WHO推薦的青蒿素聯(lián)合療法(Artemisinin-based combination therapies,ACTs)每年可以拯救數(shù)十萬(wàn)人的生命。然而,青蒿素在野生型青蒿中的含量極低(0.1-1%葉片干重),因此如何提高青蒿中青蒿素含量就成為青蒿研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題。青蒿素是倍半萜內(nèi)酯類化合物,主要在青蒿的分泌型腺毛中合成和儲(chǔ)存。提高青蒿分泌型腺毛密度和實(shí)現(xiàn)青蒿素代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控可以作為提高青蒿素含量的重要手段。但目前有關(guān)植物腺毛,尤其是分泌型腺毛發(fā)育機(jī)制研究還很少,對(duì)于青蒿中青蒿素合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究也還處于初步階段。MYB類轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,尤以R2R3MYB最為重要。它廣泛參與植物對(duì)環(huán)境的應(yīng)答、次生代謝產(chǎn)物的合成、組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育以及分生組織增殖等生理生化過(guò)程。雖然R2R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子功能多種多樣,但是在青蒿中關(guān)于R2R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控腺毛起始和青蒿素代謝的研究還很少。本研究基于青蒿全基因組、青蒿腺毛轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù),以R2R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子作為切入點(diǎn),篩選出能夠調(diào)控青蒿分泌型腺毛起始發(fā)育以及青蒿素合成的候選R2R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子。同時(shí),利用生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等研究方法對(duì)候選基因的功能進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證,取得了以下研究結(jié)果:1.克隆并鑒定了青蒿中R2R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子AaMIXTA1,發(fā)現(xiàn)AaMIXTA1能夠正向調(diào)控分泌型腺毛密度和葉片表面角質(zhì)層的合成。首先通過(guò)生物信息學(xué)及共表達(dá)分析,得到了一個(gè)R2R3MYB第9亞家族蛋白基因AaMIXTA1。對(duì)AaMIXTA1進(jìn)行表達(dá)部位分析,發(fā)現(xiàn)其在分泌型腺毛的兩個(gè)基細(xì)胞中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。轉(zhuǎn)基因青蒿實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在OE-AaMIXTA1轉(zhuǎn)基因植株中,青蒿葉片表面分泌型腺毛密度顯著上升,同時(shí)青蒿素含量也顯著上升;而在AaMIXTA1-EAR轉(zhuǎn)基因植株中分泌型腺毛密度顯著下降,且青蒿素含量也顯著下降。由此證明AaMIXTA1正向調(diào)控青蒿分泌型腺毛的起始,也表明通過(guò)調(diào)節(jié)腺毛密度來(lái)調(diào)節(jié)青蒿素的含量切實(shí)可行。此外,在OE-AaMIXTA1轉(zhuǎn)基因青蒿植株中角質(zhì)層的積累顯著高于對(duì)照植株;相反,AaMIXTA1-RNAi轉(zhuǎn)基因青蒿植株角質(zhì)層的積累則顯著低于對(duì)照植株。通過(guò)分析AaMIXTA1-RNAi轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),AaMIXTA1-RNAi轉(zhuǎn)基因青蒿植株中葉片表面的角質(zhì)層合成酶基因的表達(dá)顯著下降,如AaCYP86A1、AaCYP77A1、AaCER1、AaKCS5、AaABCG12等。Dual-LUC實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AaMIXTA1可以激活上述基因的表達(dá)。上述結(jié)果表明AaMIXTA1能夠正向調(diào)控青蒿分泌型腺毛密度和葉片表面角質(zhì)層的合成,該研究對(duì)深入闡明植物分泌型腺毛發(fā)育起始和葉片角質(zhì)層的合成調(diào)控機(jī)制具有重要意義。2.克隆并鑒定了青蒿中R2R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子AaMYB3和AaMYB6,發(fā)現(xiàn)AaMYB3可以負(fù)向調(diào)控青蒿素合成,而AaMYB6可以正向調(diào)控青蒿素合成。基于青蒿腺毛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),利用共表達(dá)分析篩選得到兩個(gè)調(diào)控青蒿素合成的R2R3MYB類轉(zhuǎn)錄因子,分別命名為AaMYB3和AaMYB6。首先,AaMYB3是在青蒿腺毛中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的青蒿素合成的負(fù)向調(diào)控因子,并且可以負(fù)向響應(yīng)MeJA。在AaMYB3-OE的轉(zhuǎn)基因青蒿植株中,青蒿素合成途徑基因的表達(dá)顯著降低,青蒿素的含量也顯著降低;在AaMYB3-Anti的轉(zhuǎn)基因青蒿植株中,青蒿素合成途徑基因的表達(dá)都顯著提高,青蒿素的含量也顯著提高;而在AaMYB3-EAR的轉(zhuǎn)基因青蒿植株中沒(méi)有檢測(cè)到青蒿素。酵母實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AaMYB3可以與AaSPL9和AaTPL相互作用。此外,AaMYB6是在青蒿分泌型腺毛中特異表達(dá)的青蒿素合成的正向調(diào)控因子,并且可以正向響應(yīng)MeJA。在AaMYB6-OE的轉(zhuǎn)基因青蒿植株中,青蒿素合成途徑基因的表達(dá)顯著上調(diào),青蒿素的含量也顯著上調(diào);而在AaMYB6-Anti、AaMYB6-EAR的轉(zhuǎn)基因青蒿植株中,青蒿素合成途徑基因的表達(dá)顯著下調(diào),青蒿素的含量也顯著下調(diào)。酵母實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AaMYB6可以與AaSPL9和AaERF2相互作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AaMYB3和AaMYB6分別是青蒿素合成的負(fù)向和正向調(diào)控因子,本研究提出了可能存在的以形成MYB-SPL-ERF復(fù)合體為基礎(chǔ)的新的次生代謝調(diào)控模型。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S567.219
【圖文】：

是從青蒿中分離獲得的一種含示）。由于青蒿素衍生物對(duì)瘧疾（Artemisinin-based Combina抗瘧療法[10]。由于青蒿素存在溶解性等問(wèn)題，研究人員對(duì)青多種具有抗瘧活性的青蒿素衍些年，不同的研究小組也發(fā)現(xiàn)病、抗感染等方面也具有一定高發(fā)的非洲地區(qū)提供大量的青

色素家族 P450 還原酶（amorpha-4,11-diene 12-hydroxylase, CYP71AV1）及其蛋白（cytochrome P450 reductase, CPR）的催化下，經(jīng)過(guò)連續(xù)的三步氧化反應(yīng)紫穗槐二烯依次氧化為青蒿醇、青蒿醛和青蒿酸[25]。CYP71AV1 是由 Teoh 2006 年在青蒿腺毛 EST 序列中分離得到的一個(gè)腺毛特異的多功能的倍半萜原酶，并通過(guò)在酵母和青蒿中表達(dá)等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其催化功能[26]。青蒿酸是青 B（arteannuin B）的直接前體，青蒿酸轉(zhuǎn)化為青蒿素 B 是非酶促的光氧化反7, 28]。然而，青蒿酸并不是青蒿素的直接前體，隨著另外兩個(gè)關(guān)鍵酶青蒿醛雙原酶（artemisinic aldehyde Δ11(13) reductase, DBR2）和乙醛脫氫酶（aldehyehydrogenase 1, ALDH1）的發(fā)現(xiàn)，表明青蒿醛才是青蒿素的直接前體物質(zhì)[29, 30BR2 破壞青蒿醛 11，13 位的雙鍵生成二氫青蒿醛，ALDH1 催化二氫青蒿醛生成二氫青蒿酸。二氫青蒿酸發(fā)生非酶促光氧化反應(yīng)生成最終的產(chǎn)物青蒿素8]。也有研究表明，在青蒿中青蒿素 B 可以轉(zhuǎn)化為青蒿素[31]。

圖 1-3 腺毛形態(tài)[93]Fig. 1-3 Trichomes morphologies1.3.2 青蒿腺毛青蒿有兩種腺毛，分泌型腺毛（glandular secretory trichomes, GSTs）和非分泌型腺毛（T-shaped non-secretory trichomes, TSTs），且都為多細(xì)胞結(jié)構(gòu)[94]，其形態(tài)如圖 1-4 所示。非分泌型腺毛又叫 T 型腺毛，來(lái)源于其外形類似于字母“T”，基部是由五個(gè)柄細(xì)胞和頭狀的莖節(jié)組成，頭部是由伸長(zhǎng)的細(xì)絲狀細(xì)胞構(gòu)成[32]。分泌型腺毛是二列的十細(xì)胞結(jié)構(gòu)：包括兩個(gè)基細(xì)胞（basal cells）、兩個(gè)柄細(xì)胞（stalkcells）、四個(gè)亞頂細(xì)胞（subapical cells）和兩個(gè)頂細(xì)胞（apical cells）。此外，在四個(gè)亞頂細(xì)胞和兩個(gè)頂細(xì)胞的外面還包裹著囊腔結(jié)構(gòu)[95]。Duke 等為了研究分泌型腺毛的結(jié)構(gòu)和發(fā)育情況，通過(guò)掃描電鏡和透射電鏡分別對(duì)青蒿分泌型腺毛的形態(tài)

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 蔣科技;皮妍;侯嶸;唐克軒;;植物內(nèi)源茉莉酸類物質(zhì)的生物合成途徑及其生物學(xué)意義[J];植物學(xué)報(bào);2010年02期

2 吳葉寬;李隆云;鐘國(guó)躍;;青蒿的研究概況[J];重慶中草藥研究;2004年02期

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本文編號(hào)：2799546