【摘要】：馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)營養(yǎng)豐富,是我國第四大作物,也是我國糧食安全的重要組成部分。紫色和紅色馬鈴薯除具有普通馬鈴薯的優(yōu)良性狀外,還含有大量的天然花青素。花青素具有清除氧自由基、殺菌和抑菌等作用,同時對一些特殊的疾病具有很好的預(yù)防和治療效果�；隈R鈴薯花青素的特殊功效,馬鈴薯花青素的相關(guān)研究受到科研人員的高度重視。當(dāng)前,馬鈴薯花青素生物合成途徑已經(jīng)基本明晰,然而開展花青素合成流向調(diào)控的研究較少,因此開展花青素合成流向調(diào)控機制的研究對豐富花青素的代謝途徑和培育彩色馬鈴薯新品種具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。本論文以紫皮紫肉的馬鈴薯SD92及其紅皮紅肉的突變體SD140為材料,通過色素分析、轉(zhuǎn)錄組測序和代謝組分析等手段探究馬鈴薯花青素生物合成過程中由紫色向紅色轉(zhuǎn)向的流向調(diào)控機制。最后采用基因克隆和轉(zhuǎn)化技術(shù)對預(yù)測的關(guān)鍵基因編碼區(qū)和啟動子區(qū)進(jìn)行序列分析和關(guān)鍵基因的功能驗證。具體結(jié)果如下:1.通過對生長期馬鈴薯SD92和SD140塊莖中的花青素進(jìn)行提取、純化和濃縮,得到高純度的色素提取液。采用高效液相色譜分析(HPLC)和質(zhì)譜分析(MS)對提取液進(jìn)行分析,結(jié)果表明,SD92中含有的花青素主要為矮牽牛色素,SD140中含有的花青素主要為天竺葵色素。2.通過RNA測序技術(shù)(RNA-seq),對紫色馬鈴薯及其紅色突變體的塊莖進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果表明,SD140與SD92進(jìn)行比較,得到295個顯著差異基因(DEGs),其中177個DEGs上調(diào)表達(dá),占全部差異基因的60.00%;118個DEGs下調(diào)表達(dá),占全部差異基因的40.00%。熒光定量PCR實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是可靠的。GO分析結(jié)果顯示DEGs主要參與催化活性的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄、大分子代謝過程的調(diào)節(jié)、單一生物過程和對刺激的反應(yīng)等生物過程。KEGG分析結(jié)果顯示DEGs主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工蛋白、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA轉(zhuǎn)運、類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、苯丙素生物合成等代謝途徑。在類黃酮化合物花青素生物合成途徑中,結(jié)構(gòu)基因表達(dá)分析顯示,在SD140中3個基因顯著下調(diào),分別編碼苯丙氨酸裂解酶(PAL)、4-香豆酸-CoA連接酶(4CL)和類黃酮3',5'-羥化酶(F3'5'H);1個基因顯著上調(diào),編碼苯丙氨酸裂解酶(PAL)。由于F3'5'H位于花青素合成的分支處,推測F3'5'H表達(dá)量的降低是塊莖矮牽牛色素向天竺葵色素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因。此外,bZIP家族,MYB家族,LOB家族,MADS家族,zf-HD家族和C2H2家族等轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因的表達(dá)也發(fā)生了顯著變化,bZIP家族、MADS家族通過調(diào)控MYB家族進(jìn)一步調(diào)節(jié)F3'5'H的表達(dá),最終導(dǎo)致花青素合成的方向由矮牽牛色素轉(zhuǎn)向天竺葵色素。赤霉素、脫落酸、乙烯和油菜素內(nèi)酯等激素的響應(yīng)蛋白在花青素轉(zhuǎn)化中也發(fā)生了顯著變化,說明這些激素響應(yīng)蛋白也參與調(diào)控花青素的合成流向。3.采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)對紫色馬鈴薯塊莖及其紅色突變體的塊莖進(jìn)行代謝組分析。主成分分析(PCA)結(jié)果顯示,在負(fù)離子模式下SD92和SD140代謝物存在明顯差異。在正負(fù)離子模式下,SD92和SD140在偏最小二乘判別分析(PLS-DA)模型中可被明顯區(qū)分。通過多元變量統(tǒng)計分析,ESI正離子模式下得到的候選生物標(biāo)志物為259個,其中105個為上調(diào),154個為下調(diào);ESI負(fù)離子模式得到的候選生物標(biāo)志物為491個,其中152個為上調(diào),339個為下調(diào)。分別對正離子和負(fù)離子模式下的11個變量進(jìn)行鑒定,共鑒定出20個生物標(biāo)志物,即差異代謝產(chǎn)物,它們包括:酪氨酸、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、天竺葵色素、芹菜素、木犀草素、山奈酚-7-O-葡萄糖苷、西伯利亞落葉松黃酮-3-葡萄糖苷、L-谷胱甘肽、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、4-氨基苯甲酸、黃嘌呤核苷、13-HpOTrE、單磷酸尿苷、環(huán)磷酸鳥苷、3',5'-環(huán)磷酸鳥苷、綠原酸、5'-單磷酸鳥苷、天竺葵素3-O-葡萄糖苷、圣草酚-7-O-葡萄糖苷和根皮苷。差異代謝產(chǎn)物的聚類分析結(jié)果顯示:根皮苷、天竺葵素3-O-葡萄糖苷、綠原酸、圣草酚-7-O-葡萄糖苷、芹菜素、山奈酚-7-O-葡萄糖苷、木犀草素、天竺葵素、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、酪氨酸和黃嘌呤核苷為一類,它們主要為類黃酮化合物,在SD140中是上調(diào)的。L-谷胱甘肽、單磷酸尿苷、5'-單磷酸鳥苷、環(huán)磷酸鳥苷、3',5'-環(huán)磷酸鳥苷、13-HpOTrE、4-氨基苯甲酸和西伯利亞落葉松黃酮-3-葡萄糖苷為一類,它們主要為核苷酸類,在SD140中是下調(diào)的。相關(guān)性分析表明這些類黃酮化合物內(nèi)部呈顯著的正相關(guān),它們主要通過二氫山奈酚來調(diào)節(jié)天竺葵素的合成。而核苷酸類物質(zhì)與天竺葵素和天竺葵素-3-O-葡萄糖苷呈顯著的負(fù)相關(guān),說明它們負(fù)向調(diào)控了天竺葵素的合成。4.為了探討F3'5'H基因差異表達(dá)的原因,通過基因克隆,分別對F3'5'H的編碼區(qū)序列和啟動子序列進(jìn)行測定,結(jié)果顯示SD92和SD140的編碼區(qū)序列及啟動子序列沒有差異。對F3'5'H啟動子序列進(jìn)一步分析,結(jié)果顯示,啟動子區(qū)域含有MYB結(jié)合位點和ABRE(脫落酸響應(yīng)元件)、ERE(乙烯響應(yīng)元件)、TATC-box(赤霉素響應(yīng)元件)、TCA-element(水楊酸響應(yīng)元件)等激素應(yīng)答元件,說明這些元件可能調(diào)控了F3'5'H的表達(dá)。這些結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析中鑒定到的MYB轉(zhuǎn)錄因子和赤霉素、脫落酸、乙烯等激素響應(yīng)蛋白的差異表達(dá)基因相呼應(yīng)的。為了進(jìn)一步驗證F3'5'H的功能,將F3'5'H轉(zhuǎn)化到SD140中,已經(jīng)初步獲得了轉(zhuǎn)基因植株,這些轉(zhuǎn)基因植株的表型變化還需要進(jìn)一步研究。這些結(jié)果有助于挖掘馬鈴薯花青素轉(zhuǎn)化的候選基因,為研究花青素轉(zhuǎn)化的分子機理提供了重要的資源,為培育富含花青素的馬鈴薯品種提供了很好的參考。
【圖文】：

其晚疫病的發(fā)生率明顯低于黃色品種[3]。種類和結(jié)構(gòu)苷類物質(zhì)，屬于花色素苷，是花色素與各糖類通過物的總稱，是一類重要的類黃酮化合物�；窘Y(jié)構(gòu) 1-1），附著于糖苷配基的糖有葡萄糖、半乳糖、木糖最為普遍�；ㄇ嗨厥且环N水溶性色素，存在于細(xì)現(xiàn)出粉色、紫色、紅色和藍(lán)色等。自然界廣泛分布gonidin)，矢車菊色素（cyanidin）及翠雀素（delph 3 種色素：芍藥花色素（peonidin）由矢車菊色素petunidin）及錦葵色素（mavlvidin)由翠雀素不同素呈磚紅色，矢車菊色素和芍藥花色素呈紫紅色錦葵色素則表現(xiàn)藍(lán)紫色[14]。

9圖 1-3 MYB 因子的進(jìn)化樹圖Fig. 1-3 Evolutionary tree of the MYB transcription factor1.2.1.2.2 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子bHLH（basic Helix-Loop-Helix）具有基本的螺旋一環(huán)一螺旋結(jié)構(gòu)。bHLH 基序約含 60 個氨基酸, 由 1 個能與 DNA 結(jié)合的堿性區(qū)域和 α 螺旋 1-環(huán)-α 螺旋2 組成，其中環(huán)的長度在不同 bHLH 蛋白中會有差異。根據(jù)它們所結(jié)合的 DNA序列不同而分成 A、B、C、D 4 個組。其中 A 組 bHLH 蛋白與 CAGCTG 結(jié)合；B 組與 CGCGTG 結(jié)合；C 組是在系統(tǒng)發(fā)生過程中從 B 組脫離出來而形成的一個獨立組；D 組沒有堿性區(qū)域，， D 組蛋白與其他 bHLH 蛋白形成二聚體從而阻礙 bHLH 蛋白與 DNA 結(jié)合[63]。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子與花青素的合成有關(guān)，部分 bHLH 因子的進(jìn)化見圖 1-4。bHLH 轉(zhuǎn)錄因子 VvMYC1 已經(jīng)在葡萄中鑒定并
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S532

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2687705