【摘要】：植物的免疫系統(tǒng)本質(zhì)上可分兩個層次。植物可通過其細胞表面的模式識別受體(Pattern Recognition Receptor,PRR)識別微生物相關(guān)或病原相關(guān)分子模式(Microbial-or PathogenAssociated Molecular Patterns,MAMPs or PAMPs),并誘導(dǎo)免疫反應(yīng)PTI(PAMP-triggered immunity)的發(fā)生。植物還能通過細胞內(nèi)部抗性基因(Resistance gene,R gene)編碼的具有多態(tài)性的NLR(Nucleotide binding domain(NBD)and Leucine-rich Repeat)蛋白識別病原體分泌到宿主細胞內(nèi)的效應(yīng)因子effector,誘導(dǎo)植物免疫ETI(effector-triggered immunity)的發(fā)生。本文從植物免疫PTI和ETI兩個層面研究煙草細胞膜蛋白PtBP1在真菌蛋白激發(fā)子PeaT1誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性途徑中的作用,以及水稻NLR蛋白對RPR1和RPR2的基因克隆和功能分析。具體的研究結(jié)果如下:1.研究明確了煙草膜蛋白PtBP1介導(dǎo)了PeaT1誘導(dǎo)的煙草系統(tǒng)抗病性。利用VIGS基因沉默技術(shù)獲得了Pea T1互作蛋白PtBP1的基因沉默株,沉默效率達到70%以上。研究PtBP1在PeaT1誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗病性中發(fā)揮的作用發(fā)現(xiàn),TMV-GFP侵染Pt BP1沉默植株組的葉片病斑數(shù)(130.25±19.99)比對照組病斑數(shù)(43.25±8.73)提高三倍。Pt BP1沉默組積累的TMV外殼蛋白(TMV-CP)的含量也顯著高于TRV陰性對照組。PtBP1的沉默還能阻斷PtBP1誘導(dǎo)的抗病相關(guān)基因的上調(diào)表達。PtBP1的沉默對Pea T1的刺激變得不再敏感,阻斷了PeaT1誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗性,因而沉默植株更容易感病。PtBP1有可能感知PeaT1的刺激并介導(dǎo)了下游的抗病性信號傳遞。2.通過生物信息學(xué)分析,確定了來源于水稻的NLR蛋白對RPR1和RPR2為本文的研究對象。RPR1和RPR2蛋白對在N-端均包含RX-CC結(jié)構(gòu)域,是典型的CC-NLR(CNL)類型蛋白,其中RPR C-端包含2個WRKY結(jié)構(gòu)域,與來自于擬南芥的NLR蛋白對RPS4/RRS1同源。利用金門克隆技術(shù)成功構(gòu)建了RPR1和RPR2的金門克隆Level-1,Level0,Level1重組載體。3.利用瞬時表達技術(shù)確定了RPR1和RPR2定位于植物細胞核,且蛋白對RPR1和RPR2與效應(yīng)蛋白PopP2共表達產(chǎn)生類HR反應(yīng),即注射區(qū)域組織表現(xiàn)出缺綠黃化。根據(jù)定位模式和識別模式明確了RPR1和RPR2與已報道的擬南芥RPS4/RRS1具有相似性,基于RPS4/RRS1作用機理的前期研究,分析了RPR1和RPR2的功能。真菌蛋白激發(fā)子Pea T1在煙草細胞膜上的互作蛋白Pt BP1的研究和NLR蛋白對RPR1和RPR2的研究,都是從分子水平研究植物和病原微生物的相互作用和協(xié)同進化的過程。本研究將為真菌蛋白激發(fā)子Pea T1誘導(dǎo)植物抗性提供理論基礎(chǔ),將擬南芥RRS1/RRS4的NLR蛋白對“誘餌模型”推廣到水稻上,對挖掘水稻抗性基因和轉(zhuǎn)基因抗性育種具有重大的意義。
【圖文】：

圖 2.1 PtBP1 基因沉默片段的選擇。A. PtBP1 和其同源蛋白的氨基酸序列比對分析。B. PtBP1 相似性分析。 C. PtBP1 基因沉默片段的 PCR 擴增Figure 2.1 VIGS DNA fragment selection of PtBP1.（A）Sequence alignment analysis of PtBP1 and irotein.（B）Sequence similarity analysis of PtBP1 and PcaP2.（C）PCR amplification of silencing fragm.3.2 PtBP1 沉默效率檢測PtBP1 基因沉默的植株和野生型植株在表型上并沒有明顯差異。TRV2-PDS 是實對照，從圖中可以看到 PDS 植株頂端的葉片有明顯的白化癥狀，而與之相鄰的野驗組 TRV2-PtBP1 基本無異。如圖所示，從左到右依次是野生型、TRV2-PDS 沉默照組，，有白化表型出現(xiàn)）和 TRV2-PtBP1 沉默植株。

圖 2.2 本生煙的基因沉默表型Figure 2.2 Phenotype of Nicotiana. Benthamiana of VIGS treatment采用熒光定量PCR的方法檢測TRV2-PtBP1沉默植株的PtBP1基因在算基因沉默植株的沉默效率。通過對實驗結(jié)果分析可知，TRV2-PtBP1相比，PtBP1 的表達量下降了近70%（圖5.9）。可認定VIGS基因沉默下來的功能分析和檢測。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S511

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本文編號：2618516