【摘要】：隨著化石能源的日漸枯竭,全球范圍內(nèi)的能源危機(jī)正不斷加重,因此尋找新的替代能源是今后發(fā)展的必由之路。生物能源是可再生、高效清潔的綠色能源,生物燃料乙醇利用植物纖維素為原料經(jīng)酶解糖化、發(fā)酵產(chǎn)生乙醇,可直接按一定比例添加到汽油中作為燃料使用。但木質(zhì)纖維素原料結(jié)構(gòu)復(fù)雜,其中高含量的木質(zhì)素直接影響了纖維素酶的轉(zhuǎn)化效率,導(dǎo)致纖維素的降解效率降低,這已經(jīng)成為制約該產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。甜高粱因因其具有生物量大,抗逆性強(qiáng)、莖稈含糖量高等優(yōu)點(diǎn)已成為當(dāng)今世界廣泛關(guān)注的新型能源作物。通過(guò)基因工程改變木質(zhì)素合成途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)而調(diào)控木質(zhì)素的合成,適當(dāng)降低其木質(zhì)素含量,已成為提高生物乙醇生產(chǎn)技術(shù)的重要途徑之一。SbbHLH1是高粱木質(zhì)素合成中的負(fù)調(diào)控因子(閆麗博士論文,2011),但對(duì)其作用機(jī)制還缺乏深入的認(rèn)識(shí)。本文通過(guò)其與其他轉(zhuǎn)錄因子及蛋白質(zhì)的互作以及靶基因啟動(dòng)子的識(shí)別、結(jié)合等研究其調(diào)控木質(zhì)素的合成機(jī)理。對(duì)已經(jīng)篩選出的兩個(gè)擬南芥過(guò)表達(dá)純系(SbbHLH1-GFP),通過(guò)苯丙烷類代謝途徑相關(guān)Marker基因的表達(dá)和Wiesner染色,進(jìn)一步證明轉(zhuǎn)錄因子SbbHLH 1對(duì)木質(zhì)素的合成有負(fù)調(diào)控作用,未受到GFP對(duì)其功能的影響,同時(shí)這有利于進(jìn)一步通過(guò)該標(biāo)簽研究該轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)部位、互作蛋白等信息。通過(guò)SbbHLH1-His重組蛋白與野生型甜高粱(S213)莖葉總蛋白、SbbHLH1-GFP過(guò)表達(dá)擬南芥總蛋白親和層析-質(zhì)譜分析(AS-MS),最終從苯基丙烷途徑中識(shí)別出11個(gè)可能的“互作”蛋白,經(jīng)酵母雙雜、BiFC等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證,最終找到參與木質(zhì)素的合成的細(xì)胞色素P450(CYP98A3)與SbbHLH1發(fā)生互作,因?yàn)锳tCYP98A3就是木質(zhì)素代謝途徑中的C3H基因,與其互作可能影響其活性,進(jìn)一步影響木質(zhì)素的合成;同時(shí)SbbHLH1轉(zhuǎn)錄因子與靶位點(diǎn)的結(jié)合及與其他蛋白的互作、降解也可能受到與C3H結(jié)合的影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)SbbHLH1轉(zhuǎn)錄因子可結(jié)合AtPAL1啟動(dòng)子的E-box(CANNTG),同時(shí)還發(fā)現(xiàn)At4CL1啟動(dòng)子的E-box也可和SbbHLH1結(jié)合。這就進(jìn)一步證明了SbbHLH1轉(zhuǎn)錄因子最少通過(guò)結(jié)合兩個(gè)苯基丙烷途徑中的重要基因E-box,調(diào)控木質(zhì)素的合成(AtPAL1和At4CL1)。對(duì)已獲得的SbbHLH1轉(zhuǎn)基因毛白楊五年生實(shí)生苗,因其為嵌合體,需進(jìn)一步進(jìn)行分子檢測(cè),對(duì)其陽(yáng)性枝條進(jìn)行纖維素降解實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明SbbHLH1轉(zhuǎn)基因毛白楊中木質(zhì)素的降低,有利于纖維素酶對(duì)其中纖維素的降解;而且木質(zhì)素的含量與纖維素的轉(zhuǎn)化率呈顯著負(fù)相關(guān)。該結(jié)果為通過(guò)基因工程技術(shù)創(chuàng)制低木質(zhì)素含量的楊樹等能源植物新品種提供一條有益的途徑。
【圖文】：

ｉｇ．ｌ邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｆｌｏｗ邋ｓｈｅｅｔ邋ｆｏｒ邋ｔｈｅ邋ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｂｉｏｍａｓｓ邋ｔｏ邋ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｘｕ邋ｅｔ邋ａｌ，邋２０１纖維素的降解轉(zhuǎn)化過(guò)程中（如圖ｉ），對(duì)原料進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理后，，維素和木質(zhì)素之間的緊密結(jié)構(gòu)，使之松散，加大空隙和容積，有利于解性能（如圖２），從而提高纖維素的轉(zhuǎn)化率。逡逑

而生物酶降解法恰恰彌補(bǔ)了這個(gè)嚴(yán)重的弊端，從而得到了越來(lái)越多的應(yīng)用。逡逑纖維素酶復(fù)合物包括內(nèi)切葡聚糖酶（ＥＧ），外切葡聚糖酶（纖維二糖水解酶Ｉ和ＩＩ）逡逑和（３－葡糖苷酶（圖３），各個(gè)纖維素酶組分彼此相互協(xié)調(diào)高效發(fā)揮作用以降解纖維素。逡逑纖維素酶可分為三大類酶：外切葡聚糖酶、內(nèi)切纖維素酶和Ｐ－葡糖苷酶。外切葡聚糖酶逡逑可分為兩類：Ｉ型酶從葡萄糖鏈的還原端進(jìn)行攻擊，而ＩＩ型從葡萄糖鏈的非還原端攻擊，逡逑均產(chǎn)生纖維二糖；再經(jīng)Ｐ－葡糖苷酶水解為單糖（Ｂａｒｒ邋ｅ／ｄ，１９９６）。內(nèi)切纖維素酶與葡逡逑萄糖鏈無(wú)規(guī)則結(jié)合，并水解一個(gè)／幾個(gè)糖苷鍵。逡逑．邐逡逑Ｇ－邋＿邋Ｇ邋－邋－－邋Ｇ－逡逑ＲＧ—Ｇ—－Ｇ—－Ｇ—Ｇ＊＊ｉｒＱｆｃＧ－：－Ｇ—Ｇ—Ｇ…Ｇ——Ｇ—ｉＧ—Ｇ—Ｇ—Ｇ邐ｍｄ逡逑（３—Ｇ—Ｇ—Ｇ＿－ｒ’＿Ｇ—■—Ｇ邐—Ｇ＾—Ｇ－＊￣Ｇ—＊Ｇ＊＊￣Ｇ邐—Ｇ逡逑（７—－ｆｊ—Ｑ——（３—逡逑＇邋Ｊ：氣：％逡逑＇０邋Ｇ逡逑Ｈｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ邋＾一ＣＢＨ邋Ｉ邐ＣＢＨ邋ＩＩ邐ｆ３－ｇｌｕｃｏｓｉｄｉｉｓｅ逡逑Ｃａｔａｌｙｔｉｃ邋Ｄｏｍａｉｎ邐Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ邋Ｂｉｎｄｉｎｇ邋Ｍｏｄｕｌｅ邋一邋＼邋Ｌｉｎｋｅｒ逡逑Ｃｉ邋Ｇｌｕｃｏｓｅ邐Ｋ邋Ｒｅｄｕｃｉｎｇ邋Ｅｎｄ邐ＮＲ邋Ｎｏｎ－Ｒｅｄｕｃｉｎｇ邋Ｅｎｄ逡逑圖３．各種纖維素酶在纖維素表面層上的作用逡逑３逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2;S514

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Jinmi Yoon;Heebak Choi;Gynheung An;;Roles of lignin biosynthesis and regulatory genes in plant development[J];Journal of Integrative Plant Biology;2015年11期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 閆麗;高粱耐鹽堿種質(zhì)資源篩選及木質(zhì)素合成相關(guān)基因鑒定[D];山東大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 劉啟松;高粱轉(zhuǎn)錄因子SbbHLH1及SbRAP調(diào)控木質(zhì)素合成代謝作用機(jī)理的研究[D];山東大學(xué);2016年

2 張媛菲;高粱木質(zhì)素代謝途徑轉(zhuǎn)錄因子SbLIM1和SbbHLH1的研究[D];山東大學(xué);2014年

3 楊大林;一種高粱細(xì)胞色素P450基因（SbCYP）的初步研究[D];山東大學(xué);2014年

本文編號(hào)：2618505