【摘要】：目的:知母,百合科知母(Anemarrhena asphodeloides Bunge)的干燥根莖,是一種傳統(tǒng)中藥,其主要的藥理活性成分是知母皂苷及其苷元,約占知母干燥根莖的6%,種類較多(近50多種)、含量豐富。目前知母皂苷BII對(duì)于阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)以及改善學(xué)習(xí)記憶能力具有明顯的效果,已經(jīng)有了深入的研究,是一個(gè)有潛力的抗AD的藥物。然而,其具體的生物合成途徑及關(guān)鍵酶基因尚不清楚。知母甾體皂苷依靠植化分離不僅成本較高,而且受制于天然藥用資源,提取物的質(zhì)量難以控制。因此本研究挖掘知母皂苷生物合成途徑上的關(guān)鍵酶基因,2,3-氧化鯊烯環(huán)化酶(2,3-oxidosqualene cyclase,OSC)、甾醇側(cè)鏈甲基轉(zhuǎn)移酶1(Sterol methyl transferase 1,SMT1)和甾醇側(cè)鏈還原酶2(Sterol side chain reductase enzyme 2,SSR2),對(duì)其進(jìn)行異源表達(dá)和生化功能驗(yàn)證,為知母皂苷合成途徑的研究奠定基礎(chǔ)。方法:(1)對(duì)知母根莖和地上部分進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,收集整理番茄中報(bào)道的甾體生物堿合成途徑中所有的基因序列以及其他主要含有甾體皂苷物種中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),通過(guò)本地Blast,找到與知母皂苷生物合成所有相關(guān)的Unigenes。然后通過(guò)在線工具,進(jìn)行基因開(kāi)放閱讀框分析,找出全長(zhǎng)和非全長(zhǎng)的序列。對(duì)知母皂苷母核合成有關(guān)的Unigenes通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行表達(dá)部位分析,結(jié)合候選基因的表達(dá)特征與知母主要成分的含量分布特點(diǎn),進(jìn)一步預(yù)測(cè)知母甾體皂苷合成途徑的候選基因。(2)克隆知母AaOSC、AaSMT1和AaSSR2候選基因,將AaOSC連接至酵母表達(dá)載體pESC-URA和pESC-HIS以及煙草表達(dá)載體pEAQ-HT-DEST1,AaSMT1和AaSSR2連接至酵母表達(dá)載體pESC-HIS,進(jìn)行異源表達(dá),利用GC/MS對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析。(3)將AaOSC和AaSMT1與其他物種中的同源基因利用MEGA軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對(duì),繪制環(huán)阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)與甾醇側(cè)鏈還原酶(Sterol methyl transferase,SMT)的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),分析其與其他物種的進(jìn)化關(guān)系。(4)利用合成生物學(xué)多片段酵母染色體同源重組技術(shù),將2,3-氧化鯊烯合成途徑中的關(guān)鍵酶基因以及知母AaOSCR12整合至酵母基因組,進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá),構(gòu)建產(chǎn)2,3-氧化鯊烯工程菌和產(chǎn)環(huán)阿屯醇酵母工程菌。結(jié)果:(1)知母根莖和地上部分轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,找到了與知母皂苷生物合成所有相關(guān)的Unigenes共40條,其中與知母皂苷母核合成有關(guān)的Unigenes有18條。(2)結(jié)合基因差異表達(dá)水平與知母皂苷、甾醇代謝含量分析,顯示知母皂苷在根中大量積累,與其合成相關(guān)的基因也在根中特異性表達(dá);根莖中甾體皂苷的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于甾醇的含量,說(shuō)明代謝流在膽固醇-甾體皂苷這條途徑上流量很大。(3)AaOSCR12的產(chǎn)物為環(huán)阿屯醇,其另一個(gè)產(chǎn)物還需進(jìn)一步分離純化鑒定結(jié)構(gòu),確定AaOSCR12為知母環(huán)阿屯醇合酶,而AaOSCL6和AaOSCL10無(wú)催化活性。AaSMT1催化環(huán)阿屯醇產(chǎn)生24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇,具有甾醇側(cè)鏈轉(zhuǎn)移酶1活性。(4)構(gòu)建了高產(chǎn)2,3-氧化鯊烯酵母工程菌Y2-SE-10和高產(chǎn)環(huán)阿屯醇酵母工程菌Y3-AaOSCR12,Y2-SE-10工程菌可以為2,3-氧化鯊烯環(huán)化酶的功能驗(yàn)證提供高含量的底物,同時(shí)也可以作為優(yōu)勢(shì)底盤(pán)菌進(jìn)行下一步基因整合;Y3-AaOSCR12工程菌可以將環(huán)阿屯醇的產(chǎn)量提高7.4倍,從而為AaSMT1和AaSSR2基因的功能提供底物支持。結(jié)論:本論文挖掘了知母皂苷生物合成途徑上的關(guān)鍵酶基因,并克隆鑒定了3條AaOSC基因、1條AaSMT1基因和2條AaSSR2基因,異源表達(dá)驗(yàn)證了AaOSCR12為知母環(huán)阿屯醇合酶。AaSMT1催化環(huán)阿屯醇產(chǎn)生24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇,具有甾醇側(cè)鏈轉(zhuǎn)移酶1活性,此外,還構(gòu)建了產(chǎn)2,3-氧化鯊烯工程菌Y2-SE-10和產(chǎn)環(huán)阿屯醇工程菌Y3-AaOSCR12,為知母皂苷生物合成途徑的解析、環(huán)阿屯醇合酶催化機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1-1 知母植物及主要的甾體皂苷母核(R1= sugar, H; R2= H, O-glc; R3= H, OH; R4=OH, OCH3; R5= OH, H)1.2 三萜類化合物生物合成途徑萜類化合物（類異戊二烯）是由多個(gè)異戊二烯（Isoprene，，C5）基本骨架單元以首尾相接的方式聚合而成的含氧衍生物的總稱，是植物產(chǎn)生的數(shù)量和種類最多的一類化學(xué)物質(zhì)，目前已發(fā)現(xiàn) 50,000 多種[10]。而三萜類化合物是一大類由 6個(gè)異戊二烯單元（C30）組成的萜類物質(zhì)，目前已知的三萜化合物約有 2 萬(wàn)余種，三萜類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜且主要來(lái)源于植物，還有許多難以通過(guò)化學(xué)合成的方法獲得。此外，少數(shù)三萜可以在于除植物之外的其它生物，如有些細(xì)菌可以合成鯊烯（squalene）[11]，海參可以合成三萜皂苷[12]。1.2.1 2,3-氧化鯊烯的生物合成

圖 1-2 甾醇和三萜生物合成途徑（改編自 Annu. Rev. Plant Biol. 2014[19]，Nature Plants,2016[32]）HMGS：羥甲基戊二酸單酰輔酶 A 合成酶；3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶 A 還原酶；SHC：鯊烯環(huán)化酶；SQE：2,3-氧化鯊烯環(huán)化酶；LAS：羊毛甾醇合酶；CAS 環(huán)阿屯醇合酶；CPQ：葫蘆素二烯醇合酶；BAS：beta-香樹(shù)素合酶。1.2.2.1 甾醇甾醇作為動(dòng)植物初生代謝產(chǎn)物，微生物，動(dòng)物，植物均含有甾醇但種類有所差別，真菌類微生物甾醇主要為麥角固醇，其合成前體為羊毛甾醇；動(dòng)物甾醇主要為膽固醇，合成前體也是羊毛甾醇；植物中則種類更多，如菜油甾醇，谷甾醇，豆甾醇等，都以環(huán)阿屯醇為合成前體。2009 年，Ohyama K 等人[33]在雙子葉植物中（擬南芥等）鑒定出了羊毛甾醇合酶，說(shuō)明了羊毛甾醇途徑不僅有助于植物甾醇的生物合成，還有助于作為次級(jí)代謝產(chǎn)物的類固醇的生物合成。甾醇作為細(xì)胞膜的重要組成成分，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激素合成方面發(fā)揮重要作用，如油菜素甾醇類(brassinosteroids,BRs)作為植物激素，能促進(jìn)植物莖的伸長(zhǎng)和細(xì)胞分裂[34]，可能
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S567.239

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本文編號(hào)：2618656