西瓜枯萎病是西瓜栽培中常見(jiàn)的土傳病害,由尖孢鐮刀菌西瓜專化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum,FON)侵染所致,已成為西瓜生產(chǎn)的主要限制因素。鐮刀菌酸(Fusaric acid)是一種鐮刀菌屬都可以分泌的非特異性毒素,是FON分泌的主要毒素。本研究中,我們通過(guò)分子生物學(xué)方法,在尖孢鐮刀菌的基礎(chǔ)上,進(jìn)行致病基因的敲除,獲得與致病菌具有相同生態(tài)位的毒力減弱菌株,用于與野生菌競(jìng)爭(zhēng)。盆栽實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)西瓜連作障礙具有一定的緩解作用,為連作障礙的克服提供了新的技術(shù)手段。接著我們將過(guò)濾富集FON菌絲進(jìn)行滅活處理,作為土壤改良劑施加,盆栽實(shí)驗(yàn)表明該處理改善了土壤微環(huán)境及西瓜生理指標(biāo),可以較好的緩解西瓜連作障礙。本研究中,我們選定尖孢鐮刀菌中參與毒素轉(zhuǎn)運(yùn)的FUBT基因,對(duì)同源保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物,獲得目的基因上下游序列,以潮霉素為篩選標(biāo)記進(jìn)行融合PCR,最終利用同源重組,制造獲得了毒素缺陷型菌株△FUBT(FO-1)。對(duì)⊿FUBT的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量進(jìn)行檢驗(yàn),與野生菌株沒(méi)有顯著性差異。缺陷菌株回接結(jié)果表明,其仍能侵染定殖西瓜。對(duì)缺陷株進(jìn)行產(chǎn)毒檢測(cè),發(fā)現(xiàn)缺陷菌株毒素產(chǎn)生減少至26.5μ...

【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２．１融合ＰＣＲ過(guò)程及引物（ＰＮＰ６）示意圖??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｆｕｓｉｏｎ?ＰＣＲ?ｐｒｏｃｅｓｓ?ａｎｄ?ｐｒｉｍｅｒｓ?（Ｐ１－Ｐ６）??

第２章尖孢鐮刀菌毒素缺陷菌株的定向構(gòu)建??行序列?ＢＬＡＳＴ?比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與?ＦｗｍＷｗｗ?ｒｗｙｐｏｒｗｗ?ＰＨＷ８０８?的?ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ??ｐｒｏｔｅｉｎ?ｓｕｐｅｒｃｏｎｔｌ．１０８的同源性較高，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的該基因的上下游序歹ｉｊ??設(shè)計(jì)引物，獲得了目的基因....

圖２．２尖孢鐮菌目的基因上下游、潮霉素抗性基因和融合序列ＰＣＲ擴(kuò)增??

種針將長(zhǎng)出的真菌菌落挖??出。一周后，計(jì)算內(nèi)生菌的分離率。??２．１．６數(shù)據(jù)分析??ＰＣＲ產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)分析軟件為ＣｌｕｓｔａｌＸ２．１，其他基本數(shù)據(jù)則用ＳＰＳＳ１３．０??軟件Ｏｎｅ－ｗａｙ?ＡＮＯＶＡ中Ｄｕｎｃａｎ’ｓ?ｔｅｓｔ檢驗(yàn)方式分析相關(guān)數(shù)據(jù)間的顯著性差??異（Ｐ＜０．０....

圖２．３尖孢鐮刀菌轉(zhuǎn)化子篩選??Ｆｉｇｕｒｅ?２．３?Ｔｒａｎｓｆｏｎｎａｎｔｓ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?Ｆｕｓａｒｉｕｍ?ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ??Ａ：濃度１００?ｐｇ／ｍＬ潮霉素ＰＤＡ培養(yǎng)基（尖孢鐮刀菌原生質(zhì)體）；??Ｂ、Ｃ：濃度ｌＯＯｐｇ／ｍＬ潮霉素ＰＤＡ培養(yǎng)基（原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的尖孢鐮刀菌）；??

第２章尖孢鐮刀菌毒素缺陷菌株的定向構(gòu)建??２．２．２轉(zhuǎn)化子篩選??經(jīng)過(guò)原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化，在含有潮霉素的再生培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)５ｄ后出??現(xiàn)菌落（如圖２．３），接著將擬轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到含有ｌＯＯ＾ｇ／ｍＬ潮霉素的ＰＤＡ培養(yǎng)??基上繼續(xù)傳代５次后，仍繼續(xù)生長(zhǎng)的確定為具有穩(wěn)定的潮霉素抗性的....

圖２．４轉(zhuǎn)化子ＰＣＲ驗(yàn)證??Ｆｉｕｒｅ?２．４?Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｗｉｔｈ?ＰＣＲ?ａｍｌｉｃａｏｎ??

第２章尖孢鐮刀菌毒素缺陷菌株的定向構(gòu)建??列一致，說(shuō)明潮霉素抗性基因已通過(guò)同源重組將目的基因缺失，確認(rèn)擬轉(zhuǎn)化子??為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子Ｆ０－１。??突變株?野生株??Ｍ?Ｍｕｔａｎｔ??＾＾ｐ？＿Ｆｕｂｌ＿ＦＲ??圖２．４轉(zhuǎn)化子ＰＣＲ驗(yàn)證??Ｆｉｇｕｒｅ?２．４?Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ....

本文編號(hào)：3970896