【目的】篩選鑒定西花薊馬Franiklinella ocicdentalis體內(nèi)與番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒(tomato zonate spot virus, TZSV)NSs蛋白互作的介體因子。【方法】利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與TZSV NSs互作的西花薊馬蛋白;進(jìn)行序列分析鑒定后,將捕獲的蛋白與NSs基因回轉(zhuǎn)到酵母細(xì)胞,利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基鑒定蛋白互作情況。再利用GST Pull-down技術(shù)驗(yàn)證TZSV NSs與鑒定出的西花薊馬蛋白的體外互作關(guān)系�！窘Y(jié)果】構(gòu)建了TZSV NSs的酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NSs,確定了誘餌質(zhì)粒對(duì)酵母AH109細(xì)胞無毒性,并且無自激活活性。序列分析發(fā)現(xiàn)與TZSV NSs互作的西花薊馬蛋白為類電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion-selective channel-like, VDAC)。酵母回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)顯示TZSV NSs與西花薊馬VDAC在酵母細(xì)胞內(nèi)存在特異性互作。GST Pull-down結(jié)果表明TZSV NSs與西花薊馬VDAC在體外存在相互作用�！窘Y(jié)論】通過酵母雙雜交和GST Pull-down技術(shù),分別在酵母細(xì)胞內(nèi)...

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【部分圖文】：

圖1PCR擴(kuò)增TZSVNSs

以TZSV侵染植株總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板,PCR擴(kuò)增TZSVNSs。如圖1所示,獲得1380bp的特異性片段,與預(yù)期TZSVNSs片段大小一致。擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建至pEASY-T1克隆載體,獲得pEASY-NSs,經(jīng)NdeⅠ/BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證,得到3928bp....

圖2pEASY-NSs克隆質(zhì)粒(A)和pGBKT7-NSs重組質(zhì)粒(B)的雙酶切鑒定

比較轉(zhuǎn)化有誘餌載體pGBKT7-NSs及空載體pGBKT7的酵母AH109細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)兩組菌落均為白色或棕色,且大小、數(shù)量均勻一致(圖3),表明NSs蛋白表達(dá)對(duì)酵母AH109細(xì)胞無毒性。比較分別轉(zhuǎn)化有pGBKT7-NSs/pGADT7-T,陽性載體pGBKT7-p53/pGADT7....

圖3pGBKT7-NSs誘餌質(zhì)粒對(duì)AH109酵母細(xì)胞的毒性

圖2pEASY-NSs克隆質(zhì)粒(A)和pGBKT7-NSs重組質(zhì)粒(B)的雙酶切鑒定2.3酵母雙雜交篩選與TZSVNSs互作的西花薊馬蛋白

圖4pGBKT7-NSs誘餌質(zhì)粒對(duì)AH109酵母細(xì)胞的自激活

將西花薊馬cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有誘餌質(zhì)粒pGBKT7-NSs的AH109感受態(tài)細(xì)胞,觀察菌落生長(zhǎng)及變藍(lán)情況(圖5)。挑取菌落生長(zhǎng)狀況變藍(lán)的菌落,接種至加有氨芐青霉素的SD/-Trp/-Leu液體培養(yǎng)基中擴(kuò)繁并提取酵母質(zhì)粒,PCR鑒定cDNA插入片段的大小。將擴(kuò)增大于500b....

本文編號(hào)：3969920