【目的】建立高效制備咖啡炭疽菌原生質(zhì)體及聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法,為開展咖啡炭疽菌的致病分子機(jī)理研究打下基礎(chǔ)�！痉椒ā恳钥Х忍烤揖吧途闎SC2-2為試驗(yàn)材料,通過(guò)PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將含有氯嘧磺隆標(biāo)記和綠色熒光蛋白報(bào)告基因(GFP)的質(zhì)粒pCB1532-G轉(zhuǎn)入BSC2-2原生質(zhì)體中,對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行遺傳穩(wěn)定檢測(cè)、PCR分子檢測(cè)和激光共聚焦顯微觀察�！窘Y(jié)果】BSC2-2對(duì)氯嘧磺隆的耐受濃度為200.0 mg/L。最佳遺傳轉(zhuǎn)化體系為:28℃下用2.5%裂解酶酶解BSC2-2菌絲2 h,收集原生質(zhì)體,再經(jīng)MTC緩沖液沖洗重懸后將質(zhì)粒pCB1532-G轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體,在RM培養(yǎng)基中混勻再生,獲得轉(zhuǎn)化子。GFP基因的PCR擴(kuò)增和分生孢子熒光觀察結(jié)果表明,GFP基因已成功插入并整合到咖啡炭疽菌BSC2-2基因組中。轉(zhuǎn)化子與野生型菌株在菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率及致病力上無(wú)明顯差別,表明GFP基因在咖啡炭疽菌BSC2-2基因組中穩(wěn)定遺傳�！窘Y(jié)論】成功建立了PEG介導(dǎo)的咖啡炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化體系,獲得與野生型菌株在菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率及致病性上無(wú)明顯差別的轉(zhuǎn)化子,為后續(xù)研究咖啡炭疽菌的基...

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【部分圖文】：

圖1BSC2-2對(duì)氯嘧磺隆的敏感性

由圖2可知，在單獨(dú)使用2.5%裂解酶作為細(xì)胞壁降解酶處理菌絲時(shí)，獲得的原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，達(dá)4.03×105個(gè)/mL，顯著高于其他處理的原生質(zhì)體產(chǎn)量（P<0.05，下同），其次是2.5%溶壁酶，2.5%蝸牛酶的效果最差，只獲得0.13×105個(gè)/mL的原生質(zhì)體；2.5%裂解酶+....

圖2降解酶對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

圖1BSC2-2對(duì)氯嘧磺隆的敏感性2.2.2裂解酶濃度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

圖3裂解酶濃度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

將所有的轉(zhuǎn)化子在含氯嘧磺隆的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)10代后，發(fā)現(xiàn)所有的轉(zhuǎn)化子仍可表現(xiàn)出對(duì)氯嘧磺隆的抗性，表明轉(zhuǎn)化子所獲得的抗性能穩(wěn)定遺傳。利用GFP基因的特異性引物GFP-F/GFP-R對(duì)隨機(jī)挑取的15個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖5）顯示，所有轉(zhuǎn)化子和質(zhì)粒均能在730bp處....

圖4酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

圖3裂解酶濃度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響圖5咖啡炭疽菌轉(zhuǎn)化子GFP基因PCR檢測(cè)結(jié)果

本文編號(hào)：3948470