發(fā)布時間：2024-03-03 16:17

　　為研究近暗散白蟻(Reticulitermes perilucifugus)β-葡萄糖苷酶RpBgl7,利用生物信息學(xué)分析β-葡萄糖苷酶RpBgl7的家族及結(jié)構(gòu)特點,構(gòu)建RpBgl7的重組表達(dá)載體pCold-TF-RpBgl7,在大腸桿菌中過量表達(dá)并純化,分析其最適反應(yīng)條件和酶動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明,RpBgl7屬于糖苷水解酶1家族,具有2個保守的谷氨酸催化殘基Glu187和Glu394。RpBgl7在BL21(DE3)中過量表達(dá),經(jīng)過鎳離子親和層析1步純化可得到高純度RpBgl7重組蛋白。以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷為底物,測得RpBgl7的最適pH值為6.0,最適溫度為70℃;動力學(xué)參數(shù)K_m=0.13 mmol/L,k_cat=3.15 s^-1。RpBgl7可耐受Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Cu²⁺和Ba²⁺,而Ca²⁺、Hg²⁺和Fe³⁺明顯...

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【部分圖文】：

圖1RpBgl7與G1NKBG和Sfβgly的序列比對

RpBgl7具有494個氨基酸殘基,分子質(zhì)量為56.7ku,理論等電點pI=5,不穩(wěn)定系數(shù)為38.4,表明RpBgl7較穩(wěn)定,適合進(jìn)行表達(dá)、純化。RpBgl7與已解析結(jié)構(gòu)的GH1家族β-葡萄糖苷酶G1NKBG(Uniprot:O61594,蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB:3ai0)、Sfβ....

圖2RpBgl7蛋白的結(jié)構(gòu)模型

圖1RpBgl7與G1NKBG和Sfβgly的序列比對2.2重組載體pCold-TF-RpBgl7的構(gòu)建

圖3RpBgl7基因的擴(kuò)增和重組載體的構(gòu)建

質(zhì)粒pCold-TF-RpBgl7所表達(dá)的RpBgl7重組蛋白的N端融合了觸發(fā)因子(TF,分子質(zhì)量為48ku),該因子作為分子伴侶,有助于重組蛋白的折疊;RpBgl7重組蛋白的N末端帶有組氨酸(6×His)標(biāo)簽。RpBgl7蛋白經(jīng)鎳離子親和層析純化后,SDS-PAGE顯示100....

圖4pCold-TF-RpBgl7表達(dá)載體結(jié)構(gòu)

圖3RpBgl7基因的擴(kuò)增和重組載體的構(gòu)建圖5RpBgl7的純化分析

本文編號：3918043