發(fā)布時間：2024-01-11 07:59

　　桿狀病毒是一類感染昆蟲的雙鏈大分子DNA病毒,通常產(chǎn)生出芽型病毒(budded virions,BV)和包涵型病毒(occlusion-derived virions,ODV)兩類形態(tài)不同的病毒粒子。苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)BV的主要囊膜蛋白GP64屬于第三類病毒膜融合蛋白家族,該家族代表性成員還包括水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)G蛋白和單純皰疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)gB等。目前,已解析的AcMNPV GP64在低pH條件下的三級結(jié)構(gòu)包含五個結(jié)構(gòu)域(domain I-V,簡稱DI-DV),但其中性pH條件下的三級結(jié)構(gòu)以及低pH誘導(dǎo)的構(gòu)象變化分子機(jī)制尚不清楚。本文針對AcMNPV GP64的DI與DV之間可能的相互作用以及晶體結(jié)構(gòu)仍未被完全解析的DIV開展了結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究,取得的主要結(jié)果如下:一、DI與DV的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系結(jié)構(gòu)分析表明,GP64 DV與DI中鄰近融合...

【文章頁數(shù)】：136 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 生物學(xué)膜融合及病毒膜融合蛋白
        1.1.1 生物學(xué)膜融合
        1.1.2 病毒感染介導(dǎo)的膜融合
        1.1.3 病毒膜融合蛋白
    1.2 桿狀病毒簡介
        1.2.1 桿狀病毒結(jié)構(gòu)類型
        1.2.2 桿狀病毒分類
        1.2.3 桿狀病毒粒子
        1.2.4 桿狀病毒的侵染過程
        1.2.5 桿狀病毒的感染周期
        1.2.6 桿狀病毒基因表達(dá)時相
        1.2.7 桿狀病毒主要膜融合蛋白
        1.2.8 桿狀病毒的應(yīng)用
    1.3 桿狀病毒膜融合蛋白GP64 的研究進(jìn)展
        1.3.1 GP64在BV感染過程中的作用
        1.3.2 GP64 蛋白的三級結(jié)構(gòu)
        1.3.3 GP64 的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系
    1.4 研究目的及意義
第二章 GP64 結(jié)構(gòu)域Ⅰ與結(jié)構(gòu)域Ⅴ的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系分析
    2.1 材料與設(shè)備
        2.1.1 細(xì)胞、菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 生化試劑及相關(guān)溶液
        2.1.4 主要儀器設(shè)備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
        2.2.3 目的片段的分離回收
        2.2.4 限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)
        2.2.5 連接反應(yīng)
        2.2.6 化學(xué)法轉(zhuǎn)化
        2.2.7 克隆子的篩選
        2.2.8 質(zhì)粒DNA的提取
        2.2.9 序列測定和分析
        2.2.10 甘油菌的保存
        2.2.11 GP64 突變體瞬時表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.12 瞬時表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9 細(xì)胞
        2.2.13 蛋白質(zhì)免疫印跡
        2.2.14 細(xì)胞表面酶聯(lián)免疫吸附
        2.2.15 細(xì)胞-細(xì)胞融合實驗及膜融合活性計算
        2.2.16 半融合及融合孔形成檢測
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 GP64 結(jié)構(gòu)域Ⅰ與 Ⅴ的氨基酸特征分析
        2.3.2 GP64 結(jié)構(gòu)域Ⅰ與 Ⅴ突變體基因的克隆及瞬時表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.3 GP64 結(jié)構(gòu)域Ⅰ與 Ⅴ突變體蛋白的表達(dá)分析
        2.3.4 GP64 結(jié)構(gòu)域Ⅰ與 Ⅴ突變體蛋白的細(xì)胞表面定位分析
        2.3.5 GP64 結(jié)構(gòu)域Ⅰ與 Ⅴ突變體蛋白的膜融合活性分析
        2.3.6 GP64 結(jié)構(gòu)域Ⅰ與 Ⅴ突變體蛋白誘導(dǎo)半融合及融合孔形成分析
        2.3.7 GP64 結(jié)構(gòu)域Ⅰ與 Ⅴ突變體蛋白在低pH條件下的構(gòu)象變化分析
    2.4 討論
第三章 GP64 結(jié)構(gòu)域Ⅳ的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系分析
    3.1 材料和設(shè)備
        3.1.1 材料及試劑
        3.1.2 主要儀器設(shè)備
    3.2 方法
        3.2.1 GP64 突變體瞬時表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.2 蛋白免疫印跡
        3.2.3 細(xì)胞表面酶聯(lián)免疫吸附
        3.2.4 細(xì)胞-細(xì)胞融合實驗及膜融合活性計算
        3.2.5 半融合及融合孔形成檢測
        3.2.6 DH10Bac(gp64^ko)感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.2.7 重組病毒bacmid的構(gòu)建
        3.2.8 病毒bacmid的電擊轉(zhuǎn)化
        3.2.9 病毒bacmid轉(zhuǎn)染Sf9 細(xì)胞
        3.2.10 病毒感染Sf9 細(xì)胞及病毒的擴(kuò)增
        3.2.11 病毒滴度測定
        3.2.12 病毒生長曲線測定
        3.2.13 病毒與細(xì)胞結(jié)合及病毒入侵分析
        3.2.14 病毒出芽釋放分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 GP64 結(jié)構(gòu)域Ⅳ的氨基酸特征分析
        3.3.2 GP64 結(jié)構(gòu)域Ⅳ突變體的克隆及瞬時表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.3 GP64 突變體蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅳ的結(jié)構(gòu)分析
        3.3.4 GP64 結(jié)構(gòu)域Ⅳ突變體蛋白的表達(dá)分析
        3.3.5 GP64 結(jié)構(gòu)域Ⅳ突變體蛋白的細(xì)胞膜表面定位分析
        3.3.6 GP64 結(jié)構(gòu)域Ⅳ突變體蛋白的膜融合活性分析
        3.3.7 GP64 結(jié)構(gòu)域Ⅳ突變體蛋白誘導(dǎo)半融合及融合孔形成分析
        3.3.8 GP64 結(jié)構(gòu)域Ⅳ突變體蛋白在低pH條件下的構(gòu)象變化分析
        3.3.9 表達(dá)GP64 及其突變體基因的重組bacmid的構(gòu)建
        3.3.10 GP64 結(jié)構(gòu)域Ⅳ氨基酸突變對BV產(chǎn)生的影響分析
        3.3.11 病毒感染條件下GP64 突變體的融合活性及構(gòu)象變化分析
        3.3.12 E390A,G391A,N381/K389A顯著影響病毒入侵
        3.3.13 E390A,G391A,N381/K389A對病毒釋放沒有顯著影響
        3.3.14 GP64 氨基酸保守性替換突變對融合活性及BV產(chǎn)生的影響分析
    3.4 討論
第四章 總結(jié)
    4.1 主要結(jié)論
    4.2 展望
    4.3 創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
附錄1 克隆GP64 突變體的PCR引物
附錄2 桿狀病毒GP64 氨基酸序列比對
致謝
作者簡介



本文編號：3877826