香蕉(Musa spp.)屬芭蕉科(Musaceae)芭蕉屬(Musa),是世界上重要的水果之一,世界上栽培香蕉的國家有130多個,以中美洲產(chǎn)量最多,其次是亞洲。香蕉枯萎病是由香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC)引起的一種非常嚴(yán)重的土傳病害,患病焦園香蕉存活率低,甚至絕收,對香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重的危害。因此本研究從土壤著手,試圖通過研究病原菌在土壤中的成活特征及與微生物的關(guān)系,從而明確病原菌在土壤中的流行學(xué)規(guī)律,為有效防控病害奠定基礎(chǔ)。本研究選取了五種不同發(fā)病程度的香蕉園土壤(A:種植蔬菜5年后輪作粉蕉;B:種植韭菜5年后輪作粉蕉;C:種植甘蔗4年后輪作粉蕉;D:種植粉蕉后輪作香蕉;E:種植粉蕉后輪作香蕉),通過人工接入同一濃度的香蕉枯萎病4號生理小種,制作成玻片,分別在接種0 d、10 d、20 d、30 d觀察香蕉枯萎病4號生理小種在不同土壤中的生長發(fā)育情況;然后通過對人工接菌后的土壤,采用熒光定量PCR的方法、平板計數(shù)方法以及高通量測序法,系統(tǒng)分析和比較枯萎病菌在不同類型土壤中的變化規(guī)律、以及土壤中各類真菌和細(xì)菌的多樣性和群落結(jié)...

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮寫詞及英漢對照
1. 前言
    1.1 香蕉枯萎病概述
        1.1.1 香蕉枯萎病的基本特征
        1.1.2 香蕉枯萎病的致病機(jī)理
        1.1.3 香蕉枯萎病田間防治方法
    1.2 香蕉枯萎病菌的檢測方法
        1.2.1 實時熒光定量PCR檢測原理
        1.2.2 實時熒光定量PCR定量方法的應(yīng)用
    1.3 土壤微生物多樣性的研究
        1.3.1 傳統(tǒng)土壤微生物多樣性研究方法
        1.3.2 分子生物學(xué)研究方法及其應(yīng)用
    1.4 病原微生物在土壤中的研究
        1.4.1 病原微生物在土壤中存活狀態(tài)
        1.4.2 土壤微生物物種和結(jié)構(gòu)多樣性
    1.5 本研究的目的和意義
2. 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 供試土壤及菌株
        2.1.2 主要試劑及試劑盒
        2.1.3 培養(yǎng)基及試劑配方
        2.1.4 主要儀器
    2.2 方法
        2.2.1 土壤理化性質(zhì)的測定
        2.2.2 土壤中FOC4分生孢子玻片的制作
        2.2.3 引物
        2.2.4 實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
            2.2.4.1 香蕉枯萎病4號生理小種基因組DNA的提取
            2.2.4.2 PCR擴(kuò)增目的基因
            2.2.4.3 PCR產(chǎn)物的回收純化
            2.2.4.4 回收DNA片段與PMD18-T載體的連接
            2.2.4.5 大腸桿菌DH5a熱擊感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.2.4.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選
            2.2.4.7 質(zhì)粒DNA的提取
            2.2.4.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
        2.2.5 土壤中FOC4總DNA的提取
            2.2.5.1 接種土壤微生物總DNA的提取
            2.2.5.2 原始土壤微生物總DNA的提取
            2.2.5.3 普通PCR檢測接種FOC4土壤中微生物DNA
        2.2.6 檢測接種FOC4土壤及原始土壤中的帶菌量
            2.2.6.1 平板計數(shù)法檢測土壤帶菌量
            2.2.6.2 定量PCR檢測土壤帶菌量
        2.2.7 帶菌土壤微生物的高通量測序分析
            2.2.7.1 土壤微生物總DNA的提取
            2.2.7.2 PCR擴(kuò)增
            2.2.7.3 土樣的 16S rDNA和ITS-rDNA的高通量測序
            2.2.7.4 生物信息學(xué)分析
3.結(jié)果
    3.1 土壤理化性質(zhì)的測定
    3.2 病菌分生孢子在五種不同土壤中的生長特征
    3.3 實時熒光定量測定土壤中FOC4的數(shù)量
        3.3.1 土壤總DNA的提取
        3.3.2 實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
        3.3.3 FOC4在接種前的土壤中的定量分析
        3.3.4 FOC4在接種 0 d的土壤中的定量分析
        3.3.5 FOC4在接種 10 d的土壤中的定量分析
        3.3.6 FOC4在接種 20 d的土壤中的定量分析
        3.3.7 FOC4在接種 30 d的土壤中的定量分析
    3.4 平板計數(shù)法測定不同時間段五種土壤接種FOC4的含量分析
    3.5 帶菌土壤微生物高通量測序分析
        3.5.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果分析
        3.5.2 高通量測序分析不同時間段五種土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性
            3.5.2.1 OTU豐度分析
            3.5.2.2 OTU稀釋曲線
            3.5.2.3 樣品復(fù)雜度（Alpha diversity）分析
            3.5.2.4 OTU shannon稀釋曲線
            3.5.2.5 OTU Rank Abundance曲線
            3.5.2.6 OTU主成成分分析
            3.5.2.7 OTU水平上的相似性分析
        3.5.3 物種分類表達(dá)譜
            3.5.3.1 細(xì)菌群落的物種分類表達(dá)譜
            3.5.3.2 真菌群落物種分類表達(dá)譜
        3.5.4 土壤群落結(jié)構(gòu)多樣性分析
            3.5.4.1 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析
            3.5.4.2 真菌群落多樣性分析
        3.5.5 土壤群落結(jié)構(gòu)Heatmap圖分析
            3.5.5.1 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的Heatmap圖
            3.5.5.2 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的Heatmap圖
        3.5.6 土壤群落結(jié)構(gòu)主成成分分析
            3.5.6.1 土壤細(xì)菌群落主成成分分析
            3.5.6.2 土壤真菌群落主成成分分析
4.結(jié)論與討論
    4.1 分生孢子不同時間段生存狀態(tài)的觀察
    4.2 計數(shù)結(jié)果分析
        4.2.1 實時熒光定量PCR定量結(jié)果分析
        4.2.2 平板計數(shù)分析
    4.3 微生物高通量測序分析
        4.3.1 土壤樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析
        4.3.2 土壤樣品真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析
    4.4 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)



本文編號：3870790