水稻干尖線蟲(Aphelenchoides besseyi)是危害水稻的最重要病原線蟲之一,分布于世界大多數(shù)的水稻種植區(qū),在國內(nèi)則廣泛分布于大陸24省,目前在環(huán)渤海稻區(qū)發(fā)生較為普遍,其不僅危害水稻,還為害草莓、菊花等多種觀賞植物和經(jīng)濟(jì)作物,造成重大經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)于水稻干尖線蟲的防治仍以使用殺線劑為主,對(duì)環(huán)境造成了污染,影響人類的生命健康。隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展,分子生物學(xué)方法成為研究植物線蟲防治新方法的重要手段和途徑。本研究對(duì)水稻干尖線蟲致病力不同的N10群體(寄主為水稻)和S24群體(寄主為草莓)進(jìn)行了miRNA高通量測(cè)序和分析,并克隆和篩選了水稻干尖線蟲的理想內(nèi)參基因,研究了這兩個(gè)群體線蟲的miRNA差異表達(dá)譜及4個(gè)高表達(dá)miRNA(miR-1、miR-34、miR-71和let-7-5p)在不同蟲態(tài)的相對(duì)表達(dá)情況,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了生物信息學(xué)分析;并通過qPCR、原位雜交和miRNA mimics等方法初步研究了水稻干線蟲部分miRN A的功能。主要研究成果如下:1、獲得了水稻干尖線蟲的miRNA測(cè)序結(jié)果和miRN A表達(dá)譜等信息;分別在N10和S24文庫中得到了817和73...

【文章頁數(shù)】：97 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮寫詞及英漢對(duì)照
1 前言
    1.1 水稻干尖線蟲及其發(fā)生概況
    1.2 miRNA概述
        1.2.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 miRNA的特點(diǎn)
        1.2.3 miRNA的生物功能
    1.3 miRNA的鑒定和檢測(cè)方法
        1.3.1 miRNA的鑒定
        1.3.2 miRNA的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
    1.4 內(nèi)參基因研究進(jìn)展
    1.5 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 供試線蟲
        2.1.2 供試植物材料
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 主要試劑
    2.2 方法
        2.2.1 水稻干尖線蟲的培養(yǎng)與分離
            2.2.1.1 胡蘿卜愈傷組織的制備和水稻干尖線蟲的擴(kuò)繁
            2.2.1.2 胡蘿卜愈傷組織上的水稻干尖線蟲分離
        2.2.2 兩個(gè)線蟲群體miRNA高通量測(cè)序及分析
            2.2.2.1 總RNA的提取
            2.2.2.2 高通量測(cè)序
            2.2.2.3 生物信息學(xué)分析
        2.2.3 miRNA高通量測(cè)序的驗(yàn)證和分析
            2.2.3.1 兩個(gè)群體間的差異miRNA選擇
            2.2.3.2 不同蟲態(tài)間的miRNA表達(dá)分析
            2.2.3.3 qPCR數(shù)據(jù)分析
            2.2.3.4 miRNA原位雜交
        2.2.4 水稻干尖線蟲qPCR內(nèi)參基因的克隆及篩選
            2.2.4.1 供試線蟲樣品的收集
            2.2.4.2 總RNA的提取與檢測(cè)
            2.2.4.3 cDNA第一鏈合成
            2.2.4.4 候選內(nèi)參基因片段的克隆和分析
            2.2.4.5 候選內(nèi)參基因的qPCR引物設(shè)計(jì)
            2.2.4.6 候選內(nèi)參基因的qPCR反應(yīng)
            2.2.4.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及基因擴(kuò)增效率
            2.2.4.8 數(shù)據(jù)分析
        2.2.5 miRNA靶基因的功能預(yù)測(cè)
        2.2.6 水稻干尖線蟲miR-34 的靶基因驗(yàn)證
            2.2.6.1 供試線蟲和試劑
            2.2.6.2 線蟲的收集、處理及回收
            2.2.6.3 miR-34 靶基因的熒光定量PCR檢測(cè)及分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 水稻干尖線蟲總RNA的提取結(jié)果
    3.2 水稻干尖線蟲高通量測(cè)序結(jié)果及生物信息學(xué)分析
        3.2.1 原始測(cè)序數(shù)據(jù)
        3.2.2 兩文庫小RNA共有和特有序列分析
        3.2.3 Rfam數(shù)據(jù)庫比對(duì)
        3.2.4 小RNA分類注釋
        3.2.5 已知miRNA和新miRN A的鑒定
            3.2.5.1 已知miRNA的鑒定
            3.2.5.2 新miRNA的預(yù)測(cè)
        3.2.6 miRNA差異表達(dá)分析
        3.2.7 兩個(gè)群體間的差異miRNA驗(yàn)證
        3.2.8 水稻干尖線蟲N10和S24群體不同蟲態(tài)間miRNA表達(dá)分析
        3.2.9 水稻干尖線蟲miR-34 原位雜交分析結(jié)果
    3.3 水稻干尖線蟲qPCR內(nèi)參基因的克隆及篩選
        3.3.1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)
        3.3.2 候選內(nèi)參基因片段克隆及分析
        3.3.3 候選內(nèi)參基因qPCR的引物分析
        3.3.4 候選內(nèi)參基因qPCR表達(dá)
        3.3.5 內(nèi)參基因的穩(wěn)定性
            3.3.5.1 ΔCt法分析
            3.3.5.2 geNorm分析
            3.3.5.3 NormFinder分析
            3.3.5.4 RefFinder分析結(jié)果
    3.4 miRNA靶基因預(yù)測(cè)及功能分析
    3.5 miRNA mimics處理后水稻干尖線蟲miR-34 和其靶基因的qPCR分析
        3.5.1 miRNA mimics處理后的miR-34 的qPCR分析
        3.5.2 miRNA mimics處理后的靶基因的qPCR分析
4 結(jié)論與討論
    4.1 水稻干尖線蟲N10和S24群體高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析
    4.2 水稻干尖線蟲N10和S24文庫miRNA的qPC R驗(yàn)證及分析
    4.3 水稻干尖線蟲的內(nèi)參基因篩選
    4.4 水稻干尖線蟲miRNA靶基因的分析
    4.5 miR-34 mimics處理水稻干尖線蟲的可行性
    4.6 本研究的創(chuàng)新性及意義
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄A miR-34預(yù)測(cè)的252個(gè)靶基因及其KEGG注釋結(jié)果
附錄B miR-34靶基因的KEGG富集結(jié)果



本文編號(hào)：3858158