家蠶是繼果蠅和按蚊之后的又一個全基因組測序的昆蟲,是一種重要的經(jīng)濟(jì)和模式生物。中國的蠶繭、蠶絲產(chǎn)量均居世界首位,但是在蠶業(yè)生產(chǎn)上總是遇到一種傳染病的影響,每年造成巨大損失,該病由家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)感染。本課題組前期對我國344個家蠶品種資源進(jìn)行了抗病鑒定,發(fā)現(xiàn)了一個高抗BmNPV的地方種,其半致死劑量是感病品系家蠶的1000倍以上。經(jīng)過10多年的培育篩選到一個高抗品系NB,再利用雜交和回交的方法,構(gòu)建了感病品系306的近等基因系BC8。遺傳分析表明NB對BmNPV的抗性表現(xiàn)出顯性單基因控制的遺傳規(guī)律。利用高抗品系NB,通過第二代高通量測序技術(shù)篩選了與抗性基因相關(guān)的多態(tài)性分子標(biāo)記,并利用遺傳群體對多態(tài)性分子標(biāo)記與抗性基因的連鎖性進(jìn)行了分析,將抗性基因定位于家蠶第23號染色體上一段區(qū)域。對該區(qū)域潛在的22個基因進(jìn)行序列分析,發(fā)現(xiàn)了一種羧酸酯酶基因—α-酯酶-42(α-esterases42),與感性品種家蠶相比在抗性品系家蠶中出現(xiàn)了突變。羧酸酯酶(Carboxylesterases)屬于多功能超家族...

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 抗BmNPV的研究進(jìn)展
        1.1.1 BmNPV的研究進(jìn)展
        1.1.2 已經(jīng)分離和鑒定得到的抗BmNPV基因
        1.1.3 抗BmNPV家蠶品種的發(fā)現(xiàn)和鑒定
        1.1.4 利用RNA干擾和CRISP/Cas9技術(shù)研究家蠶抗BmNPV
    1.2 羧酸酯酶的研究概況
        1.2.1 羧酸酯酶基因的分類和命名
        1.2.2 羧酸酯酶的分布與功能
        1.2.3 羧酸酯酶結(jié)構(gòu)特點和催化原理
        1.2.4 昆蟲羧酸酯酶與抗藥性
        1.2.5 羧酸酯酶與抗病毒
    1.3 研究目的及意義
    1.4 研究主要內(nèi)容與技術(shù)路線
        1.4.1 主要研究內(nèi)容
        1.4.2 技術(shù)路線
第二章 家蠶羧酸酯酶基因Bmae42的生物信息學(xué)分析
    2.1 實驗方法
        2.1.1 序列的來源及獲取
        2.1.2 序列分析及處理方法
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 Bmae42染色體定位和信號肽的預(yù)測
        2.2.2 Bmae42基因的序列分析及N-糖基化位點預(yù)測
        2.2.3 Bmae42與其它物種同源性分析及進(jìn)化樹的構(gòu)建
        2.2.4 Bmae42蛋白的三維結(jié)構(gòu)
    2.3 討論與小結(jié)
第三章 家蠶羧酸酯酶Bmae42基因的克隆和轉(zhuǎn)錄時相分析
    3.1 材料和試劑
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 實驗試劑
        3.1.3 常用試劑配方
        3.1.4 主要儀器設(shè)備
    3.2 主要方法
        3.2.1 總RNA提取和cDNA合成
        3.2.2 Bme42基因的引物設(shè)計和克隆
        3.2.3 PCR產(chǎn)物回收和連接
        3.2.4 轉(zhuǎn)化
        3.2.5 陽性克隆的挑選和驗證
        3.2.6 陽性克隆菌的質(zhì)粒抽提和鑒定
        3.2.7 熒光定量PCR
    3.3 結(jié)果和分析
        3.3.1 家蠶Bmae42基因全長克隆和鑒定
        3.3.2 家蠶Bmae42基因在不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄時相分析
        3.3.3 家蠶Bmae42基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄時相分析
    3.4 討論和小結(jié)
第四章 家蠶Bmae42基因的原核表達(dá)與多克隆抗體制備
    4.1 試劑和材料
        4.1.1 實驗材料
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 常用試劑配方
        4.1.4 主要儀器設(shè)備
    4.2 主要方法
        4.2.1 家蠶Bmae42基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.2.2 家蠶基因Bmae42的原核表達(dá)及鑒定
        4.2.3 Western Blot
        4.2.4 融合蛋白存在形式檢測方法
        4.2.5 包涵體復(fù)性方法
        4.2.6 包涵體蛋白純化方法
        4.2.7 Bmae42蛋白純化方法
        4.2.8 多克隆抗體血清的制備與純化
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 Bmae42基因的原核表達(dá)載體鑒定
        4.3.2 重組蛋白 306-Bmae42的原核表達(dá)
        4.3.3 重組蛋白的純化
        4.3.4 Bmae42-pET28a-sumo重組質(zhì)粒鑒定
        4.3.5 目的蛋白純化
        4.3.6 不同品種家蠶羧酸酯酶Bmae42的活性分析
        4.3.7 多克隆抗體制備和驗證
    4.4 討論和小結(jié)
第五章 BmNPV感染家蠶對Bmae42基因轉(zhuǎn)錄水平的影響
    5.1 主要材料
    5.2 主要方法
        5.2.1 BmNPV多角體病毒的繁殖與純化
        5.2.2 家蠶接種病毒及取材
        5.2.3 內(nèi)參基因篩選及引物設(shè)計
        5.2.4 RNA提取、cDNA合成、熒光定量PCR及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
        5.2.5 內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析方法
        5.2.6 抗病基因熒光定量PCR引物設(shè)計
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 NormFinder分析結(jié)果
        5.3.2 geNorm分析結(jié)果
        5.3.3 BestKeeper結(jié)果
        5.3.4 α-tubulin的蛋白表達(dá)水平
        5.3.5 BmNPV感染家蠶對其它免疫通路基因的影響
        5.3.6 BmNPV感染家蠶對羧酸酯酶Bmae42基因轉(zhuǎn)錄水平的影響
    5.4 討論與小結(jié)
第六章 Bmae42的抗BmNPV侵染分析
    6.1 試劑和材料
        6.1.1 主要材料
        6.1.2 實驗試劑
        6.1.3 常用試劑配方
    6.2 主要方法
        6.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和病毒感染
        6.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建
        6.2.3 Guide-RNA設(shè)計
        6.2.4 體外檢測靶點效率
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 瞬時表達(dá) Bmae42 對 BmNPV 增殖的影響
        6.3.2 gRNA靶點設(shè)計
        6.3.3 體外gRNA靶點效率檢測
        6.3.4 敲除Bmae42對BmNPV增殖的影響
    6.4 討論與小結(jié)
第七章 總結(jié)與展望
    7.1 主要工作總結(jié)
    7.2 工作展望
參考文獻(xiàn)
致謝
在校期間發(fā)表論文
參與科研項目



本文編號：3848322